專利名稱：抗中華鱉IL-1β多克隆抗體的制備及在檢測中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體涉及兔抗中華鳘IL-1beta (Chinesesoft-shelled turtle interleukin-1 beta, tIL_l β )多克隆抗體的制備，及其在以間接免疫熒光檢測(IFA)方法、western-blotting和ELISA檢測中華鱉IL-1 β含量的應用。
背景技術：
中華鱉屬脊索動物門、脊索動物亞門、爬行綱、無孔亞綱、龜鱉目、曲頸龜亞目、鱉科(Trionychidae)。龜鱉類動物作為古老的水生爬行動物，古生代晚期就已經出現，具有2億年的進化史，然而其形態結構保持的相對穩定性和對環境具有極強的適應能力，提示其機體內可能存在某些特殊的物質或結構，因此，具有重要的科學研究價值。同時，由于鱉類具有較高的營養、滋補價值，導致近年來人工規模化養殖快速擴張，對其病害的預防和控制也引起了廣泛的關注。因此，開展中華鱉免疫機制的研究有助于我們從比較發育免疫學的角度認識機體免疫系統的進化，也有助于我們通過免疫學方法和手段進行動物的病害控制。IL-1 家族包括 IL-1 a , IL-1 β , IL-1Ra (IL-1 receptor antagonist), IL-18,IL-33 及 IL-1F5 至 IL-1F10，其中 IL-1 α、IL-1 β , IL-18 和 IL-1Ra 等四個成員發現較早，人們對進行了廣泛而深入的研究。IL-1 β參與機體的局部和全身炎癥反應，也在機體的免疫損傷機制中起著主要的調節作用，是一個非常重要的促炎細胞因子。研究表明，它能誘導其它炎癥細胞因子(如IL-4，IL-6等)、趨化因子、粘附分子、急性期反應蛋白(Acute phase response protein, APR)等的合成,有利于機體抵抗入侵的病原微生物等。IL-1 β可以刺激滑膜細胞、軟骨細胞、成纖維細胞分泌大量PGE2、膠原酶和中性蛋白酶等，從而使關節中的膠原組織降 解、骨質吸收、局部血管通透性增加，直接參與關節的病理損傷。近年來發現多種腫瘤與IL-1 β的表達存在一定的相關性，由于IL-1 β能協同IL-2、IFN- Y誘導CTL和NK細胞的殺傷活性，促進殺傷細胞IL-2受體的表達以及成纖維細胞分泌IL-6，因此具有抗腫瘤作用。研究還發現IL-1 β能降低血糖水平，也與C0X-2的表達存在相關性。盡管，IL-1 β在參與機體的免疫防御反應中起到了積極作用，但是，IL-1 β是也介導‘‘auto-1nflammatory’’的主要細胞因子,尤其對一些慢性疾病發生發展起到了推波助瀾作用，如心肌梗塞或中風等缺血性損傷、動脈粥樣硬化、2型糖尿病、關節炎和冒煙型多發性骨髓瘤等均與其多度激活不無關系。研究表明，機體通過給予IL-1受體拮抗物(interleukin I receptor antagonist, IL-lra)、IL-1 單克隆抗體等減少 IL-1 β 數量，從而有效地緩解或減輕急性和慢性非感染性炎癥的發生發展。因此，IL-1 β的加工成熟分泌必須被精確的控制。人類IL-1 β生物學活性的多樣性為我們對中華鱉IL-1 β免疫機能的研究和病害的免疫干預預提供有益的借鑒，但由于缺乏有效的材料，如抗體等，使得我們對其的研究不能深入。本發明旨在建立兔抗tIL-Ιβ多克隆抗體的制備方法及基于該多抗的間接免疫突光檢測(IFA)方法、western-blotting檢測方法和ELISA檢測方法。
發明內容
本發明要解決的技術問題是，提供一種兔抗中華鳘IL-1beta (Chinesesoft-shelled turtle interleukin-1 beta, tIL_l β )多克隆抗體的制備方法，并進一步提供了基于該多抗的tIL-Ι β間接免疫突光檢測(IFA)方法、western-blotting檢測方法和ELISA檢測方法。為解決技術問題，本發明提供的解決技術方案為提供一種兔抗中華鳘IL-lbeta(Chinese soft-shelled turtle interleukin-1beta, tIL-1 β )多克隆抗體的制備方法,包括步驟(I)抗原(tIL-Ι β )制備對中華鱉IL-1 β基因序列PCR擴增，并引入Nde I與Xho I酶切位點，將擴增片段克隆至原核表達載體pET-30a(+)中，轉化感受態Ε. coli BL21(DE3) pLysS菌株，挑取單菌落經PCR和測序鑒定；陽性克隆以I mmol · Γ1 IPTG誘導4h，提取表達產物用SDS-PAGE檢測；N1-NTA Agarose親和層析柱純化表達重組蛋白，Western blot檢測免疫原性和Bradford法測定蛋白濃度,純化蛋白作為抗原備用；(2)動物免疫以含200 μ g重組蛋白 ^mL乳劑―1的tIL-Ιβ重組蛋白與弗氏完全佐劑1:1乳劑
ImL對6月齡大耳白實驗兔進行首免；分別間隔2周進行二免、三免，免疫原為tIL-Ιβ重組蛋白與弗氏不完全佐劑1:1乳化后的乳化劑(含300 Ug重組蛋白· mL乳劑―1) I mL ；收集分離首免后第56天血清，-20°C保存備用；(3)多克隆抗體純化將3次加強免疫后獲得多抗血清,離心,過0. 45 μ m濾膜，以proteinA Agarose對其進行純化。(4)多克隆抗體標記將獲得的兔抗tIL-Ιβ抗體純化后，用生物素標記，超濾去除未反應的生物素，收集生物素標記的兔抗tIL-Ι β抗體用ELISA方法進行樣品中tIL-Ι β含量的檢測。本發明進一步提供了利用前述抗tIL-Ιβ抗體實施間接免疫熒光檢測tIL-Ιβ的方法，包括利用BamH I/Xho I酶切位點將包含完整tIL_l β基因克隆至真核表達質粒，酶切和測序鑒定正確后，抽提質粒以轉染ΗΕΚ293，轉染后36h，棄去培養液，以O. 02M、pH7. 2磷酸緩沖液+0. 05%Tween-20的PBST洗滌3次，每次3 min,用4°C預冷甲醇固定細胞，每孔150 μ 1，-20°C下放置30 min ;同上洗滌后，加入經含5%w/v的脫脂奶粉PBST 50倍稀釋的抗tIL-Ιβ抗體，每孔50 yl，37°C作用I h ;同上洗滌后，分別加入經含5%脫脂奶粉PBST80倍稀釋的FITC-羊抗兔IgG抗體，每孔50 yl，37°C作用I h ;同上洗滌后，用含50%甘油的PBS封底，并置于熒光顯微鏡下觀察結果。本發明進一步提供了利用前述抗tIL-Ι β抗體實施western-blotting檢測tIL-Ιβ的方法，包括利用BamH I/Xho I酶切位點將包含完整tIL_l β基因克隆至真核表達質粒，酶切和測序鑒定正確后，抽提質粒以轉染ΗΕΚ293，轉染后36h，棄去培養液，收集細胞并裂解，提取細胞總蛋白，進行SDS-PAGE電泳，將凝膠分離的蛋白轉移至NC膜，用含5%脫脂奶粉的TBST (Tris緩沖液、O. 05%吐溫20)封閉，以提純的多抗為一抗，HRP標記的羊抗兔IgG為二抗(Promega公司)，4-氯-1-萘酹(4-CN)顯色并拍照。本發明進一步提供了利用前述兔抗tIL-Ιβ抗體標記后用ELISA進行tIL-Ιβ檢測的方法，包括將酶標板用一定濃度的純化兔抗tIL-Ι β抗體包被后，加入100微升待檢樣品在一定溫度下孵育1-2小時，適當洗滌后，加入生物素標記的兔抗tIL-Ι β抗體在一定溫度下孵育1-2小時，適當洗滌后，加入顯色液，直接在酶標儀上讀取OD49tlnm值，根據OD值的大小，可以了解待檢樣品中tIL-Ιβ的含量。相對于現有技術，本發明的有益效果在于本發明以重組tIL-Ιβ蛋白為抗原免疫實驗兔獲得了特異性的抗tIL-Ιβ多克隆抗體，制備的特異性抗tIL-Ιβ抗體可用于tIL-Ιβ間接免疫熒光(IFA)和western-blotting檢測。結果為通過免疫學方法和手段進行中華鱉的病害控制提供基礎。
圖1為重組中華鱉IL-1 β前體蛋白SDS-PAGE(A)的檢測分析圖。圖中，I為ρΕΤ32空載體；2為pET32-t-1L_l β誘導表達；3為細胞超聲后上清液；4為細胞超聲后沉淀。圖2為重組中華鳘IL-1 β抗His抗體western-blotting的檢測分析圖。圖3為Protein A純化抗tIL-Ιβ多抗SDS-PAGE分析圖。圖4為純化多抗檢測tIL-Ι β真核表達質粒轉染ΗΕΚ293細胞的SDS-PAGE分析圖。
具體實施例方式下面結合實施對本發明的抗體劑制備技術和應用作進一步描述。I材料與方法1.1抗原制備參考《分子克隆實驗指南》和GenBank上發表的tIL_l β蛋白基因序列(GenBank登錄號JX846915)，PCR擴增tIL-Ιβ基因，利用BamH I/Xho I酶切位點克隆至原核表達載體pET-30a(+)中，轉化感受態E. coli BL21(DE3) pLysS菌株，挑取單菌落進行PCR和測序鑒別；1 mmol · L—1 IPTG誘導陽性克隆4h，表達產物用SDS-PAGE檢測；重組蛋白用N1-NTAAgarose親和層析柱純化表達,Western blot檢測后,用飽和硫酸銨純化蛋白，Bradford法測定蛋白濃度，備用作為抗原。1. 2試驗動物試驗動物為6月齡健康大耳白實驗兔。1. 3免疫方法tIL-Ιβ重組蛋白與弗氏完全佐劑1:1乳化后的乳化劑(含200 μ g重組蛋白·ιΛ乳劑―1) I mL為進行首免；分別間隔2周進行二免、三免，免疫原為tIL-Ιβ重組蛋白與弗氏不完全佐劑1:1乳化后的乳化劑(含300 Ug重組蛋白· mL乳劑―1) I mL ;收集分離首免后第56天血清，-20 °C保存備用。
1.4多克隆抗體純化將3次加強免疫后獲得多抗血清,離心,過O. 45 μ m濾膜，以proteinA Agarose對其進行純化。1. 5免疫印跡(West-Blotting)分析多克隆抗體的反應性將SDS-PAGE電泳凝膠分離的蛋白轉移至NC膜，用含5%脫脂奶粉的TBST (Tris緩沖液、O. 05%吐溫20)封閉，以提純的多抗為一抗，HRP標記的羊抗兔IgG為二抗(Promega公司)，4_氯-1-萘酚(4-CN)顯色并拍照。1. 6間接免疫熒光(IFA)利用BamH I/Xho I酶切位點將完整tIL_l β基因克隆至真核表達質粒，酶切和測序鑒定正確后。抽提質粒以轉染ΗΕΚ293，轉染后36h，棄去培養液，以0.02Μ、ρΗ7. 2磷酸緩沖液+0. 05%Tween-20的PBST洗滌3次，每次3 min,用4°C預冷甲醇固定細胞，每孔150μ 1，-20°C下放置30 min ;同上洗滌后；加入經含5%w/v的脫脂奶粉PBST 50倍稀釋的抗tIL-Ιβ抗體或抗Flag抗體，每孔50 yl，37°C作用I h ;同上洗滌后，分別加入經含5%脫脂奶粉PBST 80倍稀釋的FITC-羊抗兔IgG抗體，每孔50 yl，37°C作用I h;同上洗滌后，用含50%甘油的PBS封底，并置于熒光顯微鏡下觀察結果。2 結果2.1 tIL-Ιβ重組蛋白表達和純化
圖1、2顯示tIL-Ιβ重組蛋白表達SDS-PAGE和western-blotting分析結果。含重組質粒pET3Oa-tIL-10的E. coli BL21(DE3)誘導表達的SDS-PAGE分析結果顯示，融合蛋白6His- tIL-Ιβ相對分子量約為18kDa(圖1)，與理論推測結果一致，表達產物經N1-NTAAgarose親和層析后純度較高(圖1)。經Bradford法測定濃度,推算出每升重組菌可純化得到目的蛋白68.9 mg ο利用抗His抗體對表達產物進行Western blot分析顯示,在轉印膜目的蛋白處出現特異性反應條帶，表明融合表達產物對抗His抗體具有良好的免疫反應性(圖2)。2. 2抗tIL-Ι β多克隆抗體純化經proteinA Agarose親和層析后的SDS-PAGE電泳顯示(圖3),純化后的多克隆抗體純度較高，幾乎不含雜蛋白，可見Mr為58 KDa重鏈和27 KDa輕鏈。2. 3 Western Blotting 檢測圖4顯示純化多抗檢測tIL-Ι β真核表達質粒轉染ΗΕΚ293細胞的SDS-PAGE分析結果。結果顯示，純化多抗不僅與tIL-Ιβ前體具有良好的反應性，而且也可與成熟tIL-Ιβ出現反應。2. 4特異性抗tIL-Ι β抗體IFA檢測tIL_l βIFA檢測轉染tILiP真核表達質粒的ΗΕΚ293細胞的結果表明，抗tIL-Ιβ多克隆抗體能與真核表達的tILl β表現特異性的結合，經FITC-羊抗兔IgG抗體作用后，表現特異性的熒光。其中，以5%脫脂奶粉作抗體稀釋液和封閉液時效果較好，顯著降低了反應背
旦
ο
權利要求
1.一種抗抗中華鱉IL-1 β多克隆抗體的制備方法，包括步驟 (1)抗原(tIL-Ιβ )制備 對中華鱉IL-1 β基因序列PCR擴增，并引入Nde I與Xho I酶切位點，將擴增片段克隆至原核表達載體pET-30a(+)中，轉化感受態Ε. coli BL21(DE3) pLysS菌株，挑取單菌落經PCR和測序鑒定；陽性克隆以I mmol -Γ1 IPTG誘導4h，提取表達產物用SDS-PAGE檢測；N1-NTA Agarose親和層析柱純化表達重組蛋白，Western blot檢測免疫原性和Bradford法測定蛋白濃度，純化蛋白作為抗原備用； (2)動物免疫 以含200 μ g重組蛋白.mL乳劑―1的tIL-Ιβ重組蛋白與弗氏完全佐劑1:1乳劑I mL對6月齡大耳白實驗兔進行首免；分別間隔2周進行二免、三免，免疫原為tIL-Ιβ重組蛋白與弗氏不完全佐劑1:1乳化后的乳化劑I mL，乳化劑含300 μ g重組蛋白· mL乳劑―1 ；收集分離首免后第56天血清，-20°C保存備用； (3)多克隆抗體純化 將3次加強免疫后獲得多抗血清,離心,過O. 45 μ m濾膜，以proteinA Agarose對其進行純化。
2.一種利用權利要求1中所述的抗tIL-Ιβ抗體實施間接免疫熒光檢測tIL-Ιβ的方法，包括 利用BamH I/Xho I酶切位點將包含完整tIL_l β基因克隆至真核表達質粒，酶切和測序鑒定正確后，抽提質粒以轉染ΗΕΚ293，轉染后36h，棄去培養液，以O. 02M、pH7. 2磷酸緩沖液+0. 05%Tween-20的PBST洗滌3次，每次3 min,用4°C預冷甲醇固定細胞，每孔150μ 1，-20°C下放置30 min ;同上洗滌后，加入經含5%w/v的脫脂奶粉PBST 50倍稀釋的抗tIL-Ιβ抗體，每孔50 yl，37°C作用I h ;同上洗滌后，分別加入經含5%脫脂奶粉PBST 80倍稀釋的FITC-羊抗兔IgG抗體，每孔50 yl，37°C作用I h ;同上洗滌后，用含50%甘油的PBS封底，并置于熒光顯微鏡下觀察結果。
3.一種利用權利要求1中所述的抗tIL-Ι β抗體實施western-blotting檢測tIL-1 β的方法，包括 利用BamH I/Xho I酶切位點將包含完整tIL_l β基因克隆至真核表達質粒，酶切和測序鑒定正確后，抽提質粒以轉染ΗΕΚ293，轉染后36h，棄去培養液，收集細胞并裂解，提取細胞總蛋白，進行SDS-PAGE電泳，將凝膠分離的蛋白轉移至NC膜，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉，以提純的多抗為一抗，HRP標記的羊抗兔IgG為二抗，4-氯-1-萘酚(4-CN)顯色并拍照；TBST為Tris緩沖液+0. 05%吐溫20。
全文摘要
本發明涉及生物技術領域，旨在提供一種抗中華鱉IL-1β多克隆抗體的制備及在檢測中的應用。該方法包括步驟抗原(tIL-1β)制備、動物免疫和多克隆抗體純化。本發明以重組tIL-1β蛋白為抗原免疫實驗兔獲得了特異性的抗tIL-1β多克隆抗體，制備的特異性抗tIL-1β抗體可用于tIL-1β間接免疫熒光(IFA)和western-blotting檢測。結果為通過免疫學方法和手段進行中華鱉的病害控制提供基礎。
文檔編號G01N33/68GK103059136SQ20121057102
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月24日 優先權日2012年12月24日
發明者李肖梁, 方維煥, 梁權 申請人:浙江大學