細菌烯酰還原酶的多克隆抗體的制備及其應用
【專利摘要】本發明屬于分子生物學領域，公開了細菌烯酰還原酶的多克隆抗體的制備及其應用。本發明的細菌烯酰還原酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，編碼細菌烯酰還原酶的核酸的堿基序列如SEQ ID No.1所示，以細菌烯酰還原酶為抗原，免疫動物制備抗血清，抗血清經過純化后得到細菌烯酰還原酶的多克隆抗體，采用蛋白質印記的檢測方法，利用細菌烯酰還原酶的多克隆抗體，證明了細菌Shewanella sp.Ac10內烯酰還原酶的表達，本發明制備的多克隆抗體的方法簡單，免疫原性強。
【專利說明】
細菌烯酰還原酶的多克隆抗體的制備及其應用
技術領域
[0001] 本發明屬于分子生物學領域，具體涉及一種細菌烯酰還原酶多克隆抗體的制備方 法。
【背景技術】
[0002] 細菌Shewanella sp.AclO是由海水中篩選到的一株低溫菌，該菌能夠在低溫下很 好的生長，并在低溫誘導條件下生產二十碳五烯酸。二十碳五烯酸作為細胞膜磷脂酰基側 鏈而存在于細胞中，具有抗氧化、抗衰老、預防心腦血管疾病的作用。同時，也可大大降低患 腫瘤的風險。二十碳五烯酸的這些有益作用表明其具有極高的應用價值。二十碳五烯酸是 人類保持健康所必須的不飽和脂肪酸，但僅存于植物和海洋生物中，人與動物不能合成。因 此利用生物合成法是生產二十碳五烯酸的一個替代途徑。
[0003] 二十碳五烯酸的合成過程中必須要有烯酰還原酶的參與，在碳鏈延伸的過程中催 化反式烯酰ACP生成酰基ACP。近年來植物中該酶參與合成二十碳五烯酸的路徑已經闡釋清 楚，而細菌中合成二十碳五烯酸的機制仍然未知，因此研究細菌中烯酰還原酶在二十碳五 烯酸合成中的作用顯得非常重要，但是該酶在野生型Shewanella sp.AclO菌株內表達量不 高，無法通過直接提取烯酰還原酶來證明該酶的表達，而且目前還沒有相關報道證明野生 型Shewanella sp.AclO內稀酰還原酶的表達。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的就是針對以上技術的不足，提供一種用于證明野生型Shewanella sp. AclO稀酰還原酶表達的多克隆抗體的制備方法。
[0005] 本發明的第一目的是提供一種細菌烯酰還原酶，所述細菌烯酰還原酶的氨基酸如 SEQ ID No.2所示的多肽；
[0006] 本發明的第二目的是以細菌烯酰還原酶作為抗原制備多克隆抗體；
[0007] 本發明的第三目的是細菌烯酰還原酶的多克隆抗體應用于細菌Shewanella sp.AclO內稀酰還原酶表達的檢測。
[0008] 為實現上述第一目的，本發明采用的技術方案是：
[0009] 1)通過PCR技術擴增如SEQ ID No.l所示的核酸片段；
[0010] 2)將核酸片段克隆入pET21a( + )載體質粒中，得到重組質粒pET21a-Enrd;
[0011] 3)將重組質粒pET21a-Enrd轉化入大腸桿菌得到重組大腸桿菌BL21(DE3)，進行培 養與誘導，裂解，純化，得到氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的細菌烯酰還原酶。
[0012] 所述培養與誘導過程為，將重組的大腸桿菌接種入含有50μg/ml氨芐的LB液體培 養基，37°C培養3~4h，待培養菌液的0D 6Q()達到0.5~0.7，將培養溫度調為28°C，并且加入終 濃度為〇. 5mM的異丙基硫代半乳糖苷（IPTG)進行誘導，待誘導菌液0D6Q()為1.8~2.2，離心， 收集菌體。
[0013] 所述裂解過程為，用Tris-HCl溶液(20mM，pH 7 · 8~8 · 2)懸浮菌體，利用超聲破碎 10~20min〇
[0014] 所述純化過程為，將裂解后的菌液離心，收集上清液，將上清液注入Ni-NTA親和層 析色譜柱，然后用咪唑緩沖液進行階段洗脫蛋白，最后將洗脫蛋白透析、濃縮處理得到細菌 烯酰還原酶。
[0015] 為實現上述第二目的，本發明采用的技術方案是：
[0016] 1)以氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示的細菌烯酰還原酶為抗原，免疫動物制備抗 血清；
[0017] 2)純化抗血清得到細菌稀酰還原酶的多克隆抗體；
[0018 ] 3)對該多克隆抗體進行濃度與效價的測定。
[0019] 為實現上述第三目的，本發明采用的技術方案是：
[0020] 利用蛋白質印跡法(Western Blotting)檢測細菌Shewanella sp.AclO內稀酰還 原酶的表達，具體實驗方法為：
[0021] 1)將細菌Shewanella sp.AclO接種至LB液體培養基中培養至0D為1.8~2.2,取1 ~2ml離心收集菌體，超聲破碎，離心、分別收集上清與沉淀樣品;將上清與沉淀樣品加入到 聚丙烯酰氨凝膠的上樣孔中。
[0022] 2)上樣后，啟動電泳儀，直到電泳結束，電泳結束后，將凝膠上的蛋白樣品通過電 轉處理轉移至PVDF膜，電轉結束后將PVDF膜干燥處理，然后在封閉液(5%脫脂奶粉）中封閉 處理lh，封閉處理后用PBST清洗PVDF膜干凈;然后用得到的多克隆抗體孵育lh后用PBST清 洗干凈，最后用二抗(羊抗兔-HRP)孵育lh后用PBST清洗干凈；
[0023] 3)將清洗完畢后的PVDF膜ECL顯影，暗室成像。
[0024]本發明中的大腸桿菌BL21(DE3)，載體質粒pET21a( + )，異丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)，Ni-NTA親和層析色譜柱均可通過公開市售的商業渠道取得。
[0025]本發明的有益效果：
[0026] 1)制備細菌稀酰還原酶多克隆抗體可以對野生型Shewanella sp.AclO內該酶的 表達提供驗證基礎。
[0027] 2)該多克隆抗體對烯酰還原酶的缺陷性的確認提供驗證基礎，還可以對外源啟動 子修飾的工程菌進行驗證。
【附圖說明】
[0028] 圖1為雙酶切載體pET21a( + )的核酸電泳圖；其中ladder為DNA分子量標準;pET21a (+)為pET2 la (+)質粒經限制性內切酶Nde I和EcoRI雙酶切后的核酸分子；
[0029] 圖2為雙酶切PCR產物的核酸電泳圖；其中ladder為DNA分子量標準;PCR product 為經PCR擴增的產物經限制性內切酶Nde I和EcoRI雙酶切后的核酸分子；
[0030] 圖3為重組質粒pET21a-Enrd示意圖；
[0031]圖4為蛋白純化SDS-PAGE分析圖；其中Μ為蛋白質分子量標準；1~14為細菌烯酰還 原酶經過純化處理后得到的洗脫蛋白的條帶；
[0032]圖5為目的蛋白SDS-PAGE電泳圖譜;其中Μ為蛋白質分子量標準；1為將圖4中12號 洗脫液SDS-PAGE電泳后，將藍色條帶切下放入透析袋經過核酸電泳槽電泳，取透析袋中的 溶液進行SDS-PAGE電泳確認純度；
[0033] 圖6為細菌稀酰還原酶多克隆抗體的Western Blotting分析圖；其中，Magic為用 于蛋白質印記的蛋白質分子量標準;S為細菌Shewanella sp.Ac 10超聲破碎離心后的上清 液;P為細菌Shewanella sp.AclO超聲破碎離心后的沉淀。
【具體實施方式】 [0034] 實施例1
[0035]細菌烯酰還原酶的制備：
[0036] 1)烯酰還原酶基因的堿基序列的確定
[0037] 在 GenBank 中輸入 NCBI Reference Sequence : NC_008345 · 1，得到Shewanel la frigidimarina NCIMB 400的全基因序列，其中找到enoyl reductase基因，經過密碼子優 化后得到如SEQ ID No. 1所示的堿基序列。
[0038] 2)重組質粒的構建
[0039] 根據PET21a( + )的多克隆位點和細菌烯酰還原酶基因的堿基序列設計引物：
[0040] 上游引物：5'-CTAGCTAGCATGACAACTCAAGTGCATAAC-3'（SEQ ID Νο·3)
[0041] 下游引物：5'-GGAATTCGCTTTTACTTGGTCAATTGG-3'（SEQ ID Νο·4)
[0042] 擴增以Shewanella sp.AclO基因組為模板，擴增反應體系如下：10XPCR反應緩沖 液5yl，25mmol/L MgS〇4 2yl，10mmol dNTP 5yl，10nmol/L引物各ΙμL，基因組DNA模板80ng， KoD-Plus DNA聚合酶ΙμL，雙蒸去離子水定容至50μ1。反應條件為:95 °C預變性5min; 95°C 30s，55°C30s，68°C 延伸 2min，共計 30 個循環;68°C 延伸 10min;15°C 保持 10min。將 PCR 擴增產 物經1 %瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收，克隆測序，測序由ABI3100測序儀完成。
[0043] 上述PCR產物回收后經限制性內切酶Ndel和EcoRI雙酶切，與經相同限制內切酶消 化的商業化載體pET21a( + )進行瓊脂糖凝膠電泳、切膠回收，如圖1與圖2所示：ladder為 marker，pET21a( + )為載體pET21a( + )經Ndel和EcoRI雙酶切的產物，PCR product為上述PCR 產物經Ndel和EcoRI雙酶切。雙酶切后的pET21a( + )與PCR產物再經高效DNA連接酶High Ligation(TOYOBO)催化連接，構建出重組質粒pET21a-Enrd，如圖3所示為重組質粒pET21a-Enrd示意圖。
[0044] 3)重組大腸桿菌的篩選，培養，誘導，裂解：
[0045] 篩選:經測序無突變的重組質粒pET21a-Enrd轉化大腸桿菌BL21(DE3)表達宿主， 利用含有50μg/ml氨芐的LB固體培養基篩選重組大腸桿菌。培養:將篩選的重組大腸桿菌置 于1000ml含有終濃度為50μg/ml的Amp LB培養基中，37°C培養4小時，待OD600達到0.6時，進 行誘導培養。誘導培養:轉入28 °C的培養搖床并向菌液中添加終濃度為0.5mM的IPTG誘導培 養至0D6Q()為2.0，4°C離心收集菌體。裂解：用Tris-HCl溶液(20mM，pH 8.0) 100ml懸浮菌體， 利用超聲破碎15min，4°C離心1小時，收集上清液。
[0046] 4)純化上清液得到純化的烯酰還原酶蛋白
[0047] 利用蛋白純化系統-Biol〇gic(BI0RAD)，將上清夜栗入Ni-NTA親和層析色譜柱，然 后用10~400mM咪唑緩沖液進行階段洗脫蛋白，收集各階段的洗脫蛋白（如圖4所示）。為了 確定蛋白的單一性，將圖4中的12號洗脫蛋白藍色的條帶切下，放入透析袋中利用核酸電泳 槽電泳，電泳完畢后取出透析袋中的溶液再進行SDS-PAGE電泳，檢查12號蛋白是否是單一 蛋白。如圖5所示，其中1為12號洗脫蛋白樣品，Μ為蛋白質分子量標準，圖中可以看出在44.3 與66.4KDa之間有單一蛋白條帶，說明12號洗脫蛋白的單一性好。將12號洗脫蛋白置于透析 袋，用20mM 1'1^8-!1(]1(口!18.0)于4<€條件過夜透析。透析后的蛋白利用離心濃縮管(細;[(3011) 濃縮得到烯酰還原酶，并利用10%SDS-PAGE檢測分析純化濃縮后的烯酰還原酶。
[0048] 實施例2
[0049] 細菌烯酰還原酶多克隆抗體的制備：
[0050] 以實施例1得到的烯酰還原酶為抗原，免疫家兔制備抗血清；
[0051 ]免疫家兔具體過程如下:免疫前采集500μ1家兔血液，作為對照血清。將實施例1得 到的純化濃縮后的烯酰還原酶作為抗原，采用皮下注射免疫2kg的白兔(Sic :NZW)，每次注 射500yg抗原，2周免疫一次，共免疫4次，采血檢測，通過ELISA方法確定抗體針對抗原的效 價，效價大于1:50000進行最終采血制備抗血清然后純化抗血清制備多克隆抗體，并檢測多 克隆抗體的濃度。
[0052] 1)多克隆抗體濃度的測定，采用BAS標準曲線法測定，具體方法為：
[0053] 1.1，CBB染色液配制:根據樣品數量，將5 X CBB染色液稀釋，充分混勻。
[0054] 1 ·2,根據需要取適量BSA標準蛋白，配制終濃度分別為lmg/ml、0·75mg/ml、0·5mg/ ml、0.25mg/ml和0.125mg/ml標準樣，并混勻。標準樣采用PBS為溶劑。
[0055] 1 · 3，取一塊酶標板，按表1加入試劑：
[0056]表1酶標板加入的試劑
[0058] 1.4,振蕩混勻后，室溫下靜置30min。
[0059] 1.5，用酶標儀測定562nm處的吸光值，以不含BSA的光吸收為空白對照，以蛋白含 量(yg)為橫坐標，吸收值為縱坐標，繪出標準曲線。
[0060] 1.6，將純化后的多克隆抗體用PBS緩沖液過夜透析，稀釋抗體，加入CBB染色液，利 用酶標儀測定562nm處的吸光值；
[0061] 1.7,根據測得的吸收值，在BSA標準曲線上計算抗體的濃度，，得出多克隆抗體的 濃度為：1.2mg/ml。
[0062] 2)多克隆抗體效價的測定，采用ELISA方法測定，具體方法為：
[0063] 2.1，將抗原用碳酸鈉緩沖液(pH 9.6)稀釋到10μg/ml，將抗原置于酶標96孔板，每 孔100μΙ孵育lh。
[0064] 2 · 2，用PBS-T將酶標96孔板清洗3次。
[0065] 2.3，用5%81^111111；[11<:封閉酶標板1小時，每孔10(^1。
[0066] 2 · 4，用PBS-T將酶標板清洗3次。
[0067] 2.5，稀釋的血清，用PBS-T稀釋血清5000倍，孵育抗原lh。
[0068] 2 · 6，用PBS-T將酶標板清洗3次。
[0069] 2.7，每孔加入10(^1!?^標記的羊抗兔抗體，用1^5-1'稀釋羊抗兔抗體5000倍，孵 育lh。
[0070] 2 · 8，利用PBS-T將酶標板清洗3次。
[0071] 2.9，清洗完畢后每孔加入10(^1顯色液4831'，反應2〇11^11后每孔加入5(^1過氧化 氫；
[0072] 3.0，最后分光光度計上測420nm上述步驟2.9中樣品的0D值，得出效價為1:16，大 于1:50000然后進彳丁最終米血制備抗血清。
[0073] 3)純化血清的過程是：將抗原蛋白-烯酰還原酶與Ni-NTA偶聯制備成抗體純化層 析柱，將所得抗血清與PBS緩沖液按照1:1的體積比例混合后，緩慢經過抗體純化層析柱，待 抗體與抗原結合后用甘氨酸溶液洗脫緩沖液進行洗脫，獲得純化的烯酰還原酶多克隆抗 體，純化的烯酰還原酶多克隆抗體利用PBS緩沖液過夜透析，次日進行濃度和效價測定。
[0074] 實施例3
[0075] 細菌稀酰還原酶的多克隆抗體應用于細菌Shewanella sp.AclO內稀酰還原酶表 達的檢測：
[0076] 采用Western Blotting抗體特異性測定方法包括以下步驟：
[0077] (1)將細菌51^￥3116113 8口.六(310接種至1^液體培養基中培養至00為1.8~2.2，取1 ~2ml離心收集菌體，300μ1 Tris-HCl(20mM，pH 8.0)重懸，超聲破碎，15000rpm離心、分別 收集上清與沉淀;上清液取20μ1與5μ1 5 X SDS上樣緩沖液混合，取10μ1進行SDS-PAGE電泳； 沉淀用30μ1 1 X SDS上樣緩沖液懸浮，取3μ1進行SDS-PAGE電泳;蛋白質分子量標準上樣量 為0·8μ1;
[0078] (2)上樣后，電泳儀恒定為18mA，直到電泳結束；電泳結束后，將凝膠上的蛋白樣品 通過電轉處理轉移至PVDF膜，設定電轉電流為0.23A，電轉時間為35min;
[0079] (3)電轉結束后將PVDF膜干燥處理，然后在5%脫脂奶粉封閉液中封閉處理lh;
[0080] (4)封閉處理后用PBST清洗PVDF膜5次；
[0081] (5)用封閉液5000稀釋純化的抗體，用稀釋后的抗體孵育lh后用PBST清洗5次；
[0082] (6)清洗完畢后用封閉液1:20000稀釋二抗(羊抗兔-HRP)，用稀釋后的二抗孵育lh 后用PBST清洗5次；
[0083] (7)將清洗完畢后的PVDF膜ECL顯影，暗室成像，成像結果如圖6所示:Magic為用于 蛋白質印記的蛋白質分子量標準;S為細菌Shewane 1 la sp.Ac 10超聲破碎離心后的上清液； ?為細菌3]16￥&11611&8口.4(310超聲破碎離心后的沉淀。其中細菌3]16￥&11611&8口.4(310超聲 破碎離心后的沉淀作為陰性對照，其中上清液經過Western Blotting后在50KDa與60KDa之 間有條帶顯現，說明該抗體可以免疫反應烯酰還原酶。
【主權項】
1. 一種細菌烯酰還原酶，其特征在于，所述細菌烯酰還原酶的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。2. -種編碼權利要求1所述的細菌烯酰還原酶的核酸，其特征在于，所述核酸的堿基序 列如SEQ ID No.l所示。3. -種如權利要求1所述的細菌烯酰還原酶的多克隆抗體的制備方法，其特征在于，包 括以下步驟： 1) 以氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的細菌烯酰還原酶為抗原，免疫動物制備抗血清； 2) 純化抗血清得到細菌烯酰還原酶的多克隆抗體。4. 根據權利要求3所述的細菌烯酰還原酶的多克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述 烯酰還原酶的制備方法為： 1) 利用PCR技術擴增SEQ ID No.l所示的核酸片段； 2) 將核酸片段克隆入載體質粒中，得到重組質粒； 3) 將重組質粒轉化入大腸桿菌得到重組大腸桿菌，經過培養與誘導、裂解、純化，得到 氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的細菌烯酰還原酶。5. 根據權利要求4所述的細菌烯酰還原酶的多克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述 大腸桿菌為大腸桿菌BL21 (DE3);所述載體質粒為pET21 a (+)。6. 根據權利要求4所述的細菌烯酰還原酶的多克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述 PCR技術擴增中所用的引物為：上游引物如SEQ ID No.3所示；下游引物如SEQ ID No.4所 不。7. 根據權利要求4所述的細菌烯酰還原酶的多克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述 培養與誘導過程為，將重組的大腸桿菌接種入含有50μg/ml氨芐的LB液體培養基，37 °C培養 3~4h，待培養菌液的OD600達到0.5~0.7，將培養溫度調為28°C，并且加入終濃度為0.5mM的 IPTG進行誘導，待誘導菌液OD600為1.8~2.2，離心，收集菌體。8. 根據權利要求4所述的細菌烯酰還原酶的多克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述 純化的過程為:將裂解后的菌液離心，收集上清液，將上清液注入Ni-NTA親和層析色譜柱， 然后用咪唑緩沖液進行階段洗脫蛋白，最后將洗脫蛋白透析、濃縮處理得到細菌烯酰還原 酶。9. 一種細菌烯酰還原酶的多克隆抗體的應用，其特征在于，所述細菌烯酰還原酶的多 克隆抗體在檢測細菌Shewanella sp.AclO內稀酰還原酶的表達的應用。10. 根據權利要求9所述的細菌烯酰還原酶的多克隆抗體的應用，其特征在于，所述檢 測方法為蛋白質印跡法。
【文檔編號】C07K16/06GK105936896SQ201610492730
【公開日】2016年9月14日
【申請日】2016年6月28日
【發明人】宮春杰, 胡征, 張華山, 王偉平
【申請人】湖北工業大學