專利名稱：一種a型口蹄疫146s抗原定量elisa檢測方法及其試劑盒和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種A型口蹄疫146S抗原定量ELISA檢測方法及其試劑盒和應用。
背景技術：
口蹄疫(foot and mouth disease, FMD)是豬、牛、羊等主要家畜和其它偶蹄動物共患的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，易感動物達70多種。臨床特征是在口腔黏膜、蹄部和乳房皮膚發生水皰性疹。該病傳播途徑多、速度快，曾多次在世界范圍內暴發流行，造成巨大政治、經濟損失。世界動物衛生組織(OIE)將其列為必須申報的傳染病，我國也將其列為一類動物傳染病之首。口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus, FMDV)屬于微核糖核酸病毒科口蹄疫病毒屬，有七個血清型:0型、A型、亞洲I型、C型以及南非1、2、3型。各血清型之間沒有交叉保護。現階段我國主要流行O型、A型和亞洲I型。疫苗接種是預防、控制口蹄疫的有效手段之一。在我國，口蹄疫滅活疫苗使用最為廣泛；為確保它安全有效，對其質量進行嚴格的控制極為必要。目前，國際上通用的疫苗效力檢測方法是本動物攻毒保護試驗，或采用TO5tl測定法(歐洲):即用疫苗50%動物保護劑量(PD50)來評價疫苗免疫效果，常規疫苗需至少達到3個TO5tl，緊急接種疫苗需至少達到6個PD50 ;或采用(PGP)測定法(南美):即用疫苗保護百分率(PGP)來評價疫苗免疫效果，PGP達到75%以上，該疫苗合格，PGP為62.5% 68.8%，需要進行重復檢驗，PGP小于62%，該疫苗不合格。本動物攻毒保護試驗的動物必須是來自無口蹄疫地區、無口蹄疫病毒中和抗體的非疫苗免疫本動物。由于我國采取強制免疫手段控制口蹄疫的流行和暴發，所以篩選試驗動物相當困難；另外，這種方法的成本高、周期長、重復性較差，且需要高安全動物舍，不易操作。為此，研究者開展了多種檢驗方法的研究，嘗試替代本動物攻毒保護試驗。這些研究主要分為三類:血清學替代法、試驗動物替代法和疫苗抗原定量法。口蹄疫血清學效力檢測替代方法是通過檢測疫苗免疫后的抗體滴度水平來評價疫苗免疫效力，主要包括病毒中和試驗和液相阻斷ELISA試驗。1968年，Stellman等提出了用中和抗體滴度分析疫苗效力的統計學方法；到1976年，Pay等根據中和抗體滴度和疫苗效力的關系建立了疫苗的抗原劑量、中和抗體滴度和保護率的相關公式。馬軍武等通過液相阻斷ELISA檢測疫苗免疫抗體與攻毒保護分析確定了牛、羊、豬等口蹄疫免疫抗體與攻毒保護的關系。疫苗免疫血清抗體效價檢測須用非口蹄疫疫苗免疫動物，無法從根本上取代本動物的使用，動物的選擇仍存在困難。試驗動物替代法是用試驗動物(如小鼠、豚鼠等)代替本動物，進行疫苗效力檢驗。研究發現，用豚鼠進行牛口蹄疫滅活疫苗的效力試驗，與本動物效力檢驗的TO5tl之間有較好的相關性(Eissner等1976; Terpstra等1976),也可用小鼠或BALB/c小鼠替代牛間接評價了 口蹄疫滅活疫苗的效力(Sutmoller等1980 ；DusSantos等2000)。替代性試驗動物適合規模養殖，均一'I"生容易控制，試驗動物與本動物攻毒后的F1D5tl呈一定的正相關關系，但替代性試驗動物的與本動物的免疫反應有一定差別，而且替代性試驗動物人工感染病毒時使用的是試驗株，與天然感染在株系和感染途經上存在區別。口蹄疫病毒在蔗糖密度梯度離心時，根據沉降系數不同，可以分為完整病毒粒子(146S或140S)、空衣殼(76S)、病毒感染相關肽(45S)、12 S蛋白亞單位(12S)。研究發現，完整病毒粒子(146S或140S)是口蹄疫滅活疫苗中誘導動物機體產生保護性免疫應答的主要成分，因此疫苗中完整病毒粒子含量與疫苗的免疫保護效力具有明顯相關性。FMD疫苗抗原定量的各種方法也是據此研發的，主要包括蔗糖密度梯度離心法、單抗夾心ELISA法和尺寸排阻層析法。1971年，Fayet等建立了用紫外光定量檢測蔗糖梯度中口蹄疫完整病毒粒子(146S或140S)的方法；隨后，Barteling and Meloen (1974)和Doel等對其進一步完善，并于1982年向OIE正式推薦。在此后的三十多年中，該方法一直作為口蹄疫疫苗抗原定量的經典方法被世界各國的口蹄疫疫苗研究者和供應商廣泛使用。但這種方法也有其缺點:操作復雜、儀器昂貴、重復性較差、不適合大量樣品檢測，還不能區分血清型。與之相比，Van Maanen等(1990年)和Crowther等(1995)建立的單抗夾心ELISA方法更具優勢:操作簡單、省時省力、穩定性好、適合于批量檢測，且能區分血清型(在檢測雙價苗和多價苗尤為重要)。他們以針對VPl線性表位的中和性單克隆抗體作為捕獲抗體和檢測抗體，建立了能檢測146S抗原的雙抗夾心ELISA，且不受12 S蛋白亞單位存在的影響。但這樣的單克隆抗體不容易分離到，限制了其廣泛應用。尺寸排阻色譜法，又稱為凝膠過濾色譜，或分子篩色譜法，是一種液相色譜分離技術。主要用于大分子物質如蛋白質的分離。這一技術也被用于FMD病毒粒子的分離、定量(Spitteler等，2011 )，先將口蹄疫抗原用分子篩分離，再用紫外光測定(254nm)，計算口蹄疫完整病毒粒子(140S)的含量。據報道，這種方法的檢測結果與蔗糖密度梯度離心法的符合性很好，操作也較后者簡單；但它同后者一樣，不能區分血清型。口蹄疫滅活疫苗本動物效力檢驗替代方法的探索是國內外面臨和亟待解決的一個問題，有效的替代方法應該具有很好的特異性、敏感性和重復性，而且要易于標準化。
發明內容
本發明的目的就是針對上述現有技術中的缺陷，提供了一種既保持了蔗糖密度梯度離心法的優勢，又具有ELISA方法的特長的A型口蹄疫146S抗原定量ELISA檢測方法。為了實現上述目的，本發明提供的技術方案為:一種A型口蹄疫146S抗原定量ELISA檢測方法，包括以下步驟:
1)儲備A型口蹄疫標準對照抗原；
2)純化定量A型口蹄疫標準對照抗原146S；
3)建立A型口蹄疫間接夾心ELISA方法；
4)繪制標準對照抗原標準曲線；
5)計算被檢樣品146S抗原含量；
6)檢測敏感性和特異性。進一步的，上述的一種A型口蹄疫146S抗原定量ELISA檢測方法，所述步驟I)中，是對A型口蹄疫標準對照抗原，一部分按5 mL /瓶，置_70°C儲備(僅解凍一次，用于ELISA試驗)；另一部分按3X100 mL，置-70°C儲備(僅解凍一次，用于146S抗原純化定量(分三次))。進一步的，上述的一種A型口蹄疫146S抗原定量ELISA檢測方法，所述步驟2)中，是利用蔗糖密度梯度法(45%、35%、25%、15%)，對A型口蹄疫標準對照抗原進行純化，測定146S抗原含量為2.42 μ g/ml。進一步的，上述的一種A型口蹄疫146S抗原定量ELISA檢測方法，所述步驟3)中，建立A型口蹄疫間接夾心ELISA方法的過程具體如下:
a)包被ELISA板:用碳酸鹽包被緩沖液(pH9.6)稀釋口蹄疫A型兔抗血清(蘭州獸醫研究所提供)至工作濃度(1:1000)即將Iy I 口蹄疫A型兔抗血清加入1000 μ I碳酸鹽包被緩沖液中)，混勻，每孔加50 μ l于底部，震蕩2-3分鐘后用封板膜封板或置濕盒中室溫過夜；
b)洗滌ELISA板:揭掉封板膜，棄去ELISA板中液體，每孔加滿洗滌液(0.0lM pH 7.4磷酸鹽吐溫緩沖液，I XPBST)，靜置30秒后棄去液體，重復4次，拍干；
c)加樣:用IXPBST將對照抗原和被檢抗原從1:2，即50μI抗原加50 μ I PBST，開始做2倍連續稀釋至1:256，每孔加50 μ 1，37°C，溫育1小時，用PBST洗滌ELISA板4次，拍干;
d)加二抗:用豚鼠抗血清稀釋液稀釋口蹄疫A型豚鼠抗血清至工作濃度(1:1000,即將Ιμ 口蹄疫A型豚鼠抗血清加入1000 μ I豚鼠抗血清稀釋液中)，豚鼠抗血清稀釋液為含10%正常牛血清，5%健康兔血清的PBST，每孔加50μ 1，封板，37°C，溫育I小時后用PBST洗滌ELISA板4次，拍干；
e)加酶:用IXPBST稀釋兔抗豚鼠-辣根過氧化物酶結合物至工作濃度(1:500，即將I μ I兔抗豚鼠-辣根過氧化物酶結合物加入1000 μ I PBST中)，每孔加50 μ 1，37°C溫育I小時后用PBST洗滌ELISA板4次，拍干；
f)顯色:每孔加50μ I底物溶液，37°C溫育15分鐘，所述底物溶液為20mmol/L鄰苯二胺0PD，0.05M檸檬酸磷酸鹽緩沖液，0.015%H202 ；
g)終止:每孔再加50μ I終止液終止反應，所述終止溶液為濃度為1.25%的H2SO4 ；
h)測定:在490nm波長下讀取光吸收值。進一步的，上述的一種A型口蹄疫146S抗原定量ELISA檢測方法，所述步驟4)中，是以標準對照抗原的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制標準曲線。進一步的，上述的一種A型口蹄疫146S抗原定量ELISA檢測方法，所述步驟5)中，是以樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度，再乘以稀釋倍數，得到樣品的實際濃度；
或以標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，得到樣品的實際濃度。進一步的，上述的一種A型口蹄疫146S抗原定量ELISA檢測方法，所述步驟6)中，是將A型口蹄疫146S抗原作系列稀釋，用標準對照抗原的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式的最小抗原含量，將待測口蹄疫抗原作為被檢抗原時，檢測反應OD值小于標準對照抗原的敏感性檢測值。本發明的第二個目的是提供了一種A型口蹄疫146S抗原定量ELISA檢測試劑盒，所述A型口蹄疫146S抗原定量ELISA檢測試劑盒是以上述的A型口蹄疫146S抗原定量ELISA檢測方法進行檢測的。本發明的第三個目的是提供了一種A型口蹄疫146S抗原定量ELISA檢測試劑盒在A型口蹄疫抗原定量和抗原分型中的應用。本發明的第四個目的是提供了一種A型口蹄疫146S抗原定量ELISA檢測試劑盒在口蹄疫質量評估和抗原分型中的應用。A型口蹄疫146S抗原定量ELISA試劑盒，基本原理是先用蔗糖密度梯度離心法對A型口蹄疫抗原進行定量(平行3次)，以它為標準對照抗原，對其它樣品進行ELISA檢測，先用口蹄疫A型兔血清包被微孔板，制成固相抗體，依次加入抗原樣品、口蹄疫A型豚鼠血清、辣根過氧物酶標記的抗豚鼠IgG，形成包被抗體-抗原-第二抗體-酶標抗體復合物，再加底物溶液顯色、加酸終止，顏色的深淺和樣品中的A型口蹄疫146S抗原濃度呈正相關。用酶標儀在490nm波長下測定吸光度(0D值)，通過標準曲線計算樣品中A型口蹄疫抗原的濃度。本發明的有益效果為:本發明提供的一種A型口蹄疫146S抗原定量ELISA檢測方法既保持了蔗糖密度梯度離心法的優勢(國際公認)，又具有ELISA方法的特長，本發明建立的抗原定量的間接夾心ELISA方法，重點解決了 A型口蹄疫抗原定量和疫苗效力檢驗替代問題；本發明在測定口蹄疫抗原的含量時，既能計算出抗原含量，又能對抗原進行分型，以其原理制備的試劑盒，敏感、特異、操作簡單、省時省力、穩定性好、適合于批量檢測，且能區分血清型，既可用于A型口蹄疫疫苗生產中半成品的在線監測，又可優化疫苗生產工藝，還可作為口蹄疫成品疫苗體外檢驗技術，評估疫苗的質量，替代本動物的效力試驗。本發明將在抗原生產在線監測、疫苗工藝優化、疫苗質量評估、疫苗效力檢驗等方面發揮重要作用。實驗效果說明:
1、A型口蹄疫146S抗原定量ELISA檢測方法在A型口蹄疫抗原定量和抗原分型中的應用:
用A型口蹄疫間接夾心ELISA方法對5份A型口蹄疫病毒146s抗原含量測定三次，結果穩定、重復性好，同時檢測2份其它型的抗原(O型和亞洲I型)，結果均低于其敏感性范圍，表明該發明的特異性好。如表I所示為間接ELISA對5份A型口蹄疫病毒抗原和2份其它型抗原146s抗原含量測定結果。
權利要求
1.一種A型口蹄疫146S抗原定量ELISA檢測方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)儲備A型口蹄疫標準對照抗原； 2)純化定量A型口蹄疫標準對照抗原146S； 3)建立A型口蹄疫間接夾心ELISA方法； 4)繪制標準對照抗原標準曲線； 5)計算被檢樣品146S抗原含量； 6)檢測敏感性和特異性。
2.根據權利要求1所述的一種A型口蹄疫146S抗原定量ELISA檢測方法，其特征在于，所述步驟I)中，對A型口蹄疫標準對照抗原，一部分按5mL/瓶，置于-70°C儲備，此部分僅解凍一次，用于ELISA試驗；另一部分按3X100 mL，置于_70°C儲備，此部分僅解凍一次，分三次用于146S抗原純化定量。
3.根據權利要求2所述的一種A型口蹄疫146S抗原定量ELISA檢測方法，其特征在于，所述步驟2)中，是利用蔗糖密度梯度法，梯度濃度為45%、35%、25%、15%，純化A型口蹄疫標準對照抗原，三次測得146S抗原含量的平均值為1.74μ g/ml。
4.根據權利要求3所述的一種A型口蹄疫146S抗原定量ELISA檢測方法，其特征在于，所述步驟3)中，建立A型口蹄疫間接夾心ELISA方法的過程具體如下: a)包被ELISA板:用pH9.6的碳酸鹽包被緩沖液稀釋口蹄疫A型兔抗血清至工作濃度，工作濃度為1:1000，即將Iy I 口蹄疫A型兔抗血清加入1000 μ I碳酸鹽包被緩沖液中，混勻，每孔加50 μ I于底 部，震蕩2-3分鐘后用封板膜封板或置濕盒中室溫過夜； b)洗滌ELISA板:揭掉封板膜，棄去ELISA板中液體，每孔加滿洗滌液，洗滌液為0.01M,pH 7.4的磷酸鹽吐溫緩沖液，I X PBST,靜置30秒后棄去液體，重復4次，拍干； c)加樣:用IXPBST將對照抗原和被檢抗原從1: 2，即50 μ I抗原加50 μ I PBST,開始做2倍連續稀釋至1:256，每孔加50 μ 1，37°C，溫育I小時，用PBST洗滌ELISA板4次，拍干; d)加二抗:用豚鼠抗血清稀釋液稀釋口蹄疫A型豚鼠抗血清至工作濃度，工作濃度為1:1000，即將14 1 口蹄疫A型豚鼠抗血清加入1000 μ I豚鼠抗血清稀釋液中，豚鼠抗血清稀釋液為含10%正常牛血清，5%健康兔血清的PBST，每孔加50μ 1，封板，37°C，溫育I小時后用PBST洗滌ELISA板4次，拍干； e)加酶:用IXPBST稀釋兔抗豚鼠-辣根過氧化物酶結合物至工作濃度，工作濃度為1:500，即將I μ I兔抗豚鼠-辣根過氧化物酶結合物加入1000 μ I PBST中，每孔加50μ I,37°C溫育I小時后用PBST洗滌ELISA板4次，拍干； f)顯色:每孔加50μ I底物溶液，37°C溫育15分鐘，所述底物溶液為20mmol/L鄰苯二胺OPD，0.05M檸檬酸磷酸鹽緩沖液，0.015%H202 ； g)終止:每孔再加50μ I終止液終止反應，所述終止溶液為濃度為1.25%的H2SO4 ； h)測定:在490nm波長下讀取光吸收值。
5.根據權利要求4所述的一種A型口蹄疫146S抗原定量ELISA檢測方法，其特征在于，所述步驟4)中，是以標準對照抗原的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制標準曲線。
6.根據權利要求5所述的一種A型口蹄疫146S抗原定量ELISA檢測方法，其特征在于，所述步驟5)中，是以樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度，再乘以稀釋倍數，得到樣品的實際濃度； 或以標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，得到樣品的實際濃度。
7.根據權利要求6所述的一種A型口蹄疫146S抗原定量ELISA檢測方法，其特征在于，所述步驟6)中，是將A型口蹄疫146S抗原作系列稀釋，用標準對照抗原的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式的最小抗原含量，將待測口蹄疫抗原作為被檢抗原時，檢測反應OD值小于標準對照抗原的敏感性檢測值。
8.一種A型口蹄疫146S抗原定量ELISA檢測試劑盒，其特征在于，所述A型口蹄疫146S抗原定量ELIS A檢測試劑盒是以權利要求1_7任一所述的A型口蹄疫146S抗原定量ELISA檢測方法進行檢測的。
9.一種A型口蹄疫146S抗原定量ELISA檢測試劑盒在A型口蹄疫抗原定量和抗原分型中的應用。
10.一種A型口蹄疫146S抗原定量ELISA檢測試劑盒在口蹄疫疫苗質量評估和抗原分型中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種A型口蹄疫146S抗原定量ELISA檢測方法，包括以下步驟1)儲備A型口蹄疫標準對照抗原；2)純化定量A型口蹄疫標準對照抗原146S；3)建立A型口蹄疫間接夾心ELISA方法；4)繪制標準對照抗原標準曲線；5)計算被檢樣品146S抗原含量；6)檢測敏感性和特異性。并提供了應用此檢測方法的試劑盒。本發明的有益效果為本發明提供的一種A型口蹄疫146S抗原定量ELISA檢測方法在測定口蹄疫抗原的含量時，既能計算出抗原含量，又能對抗原進行分型，以其原理制備的試劑盒，敏感、特異、操作簡單、省時省力、穩定性好、適合于批量檢測，且能區分血清型。
文檔編號G01N33/569GK103091490SQ201310017209
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月17日 優先權日2013年1月17日
發明者馬軍武, 馮霞, 周廣青, 楊亞民 申請人:中國農業科學院蘭州獸醫研究所