專利名稱：多個抗口蹄疫shRNA串聯表達載體、其構建方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程、病毒學領域，具體涉及一種多個抗口蹄疫shRNA串聯表達載體、其構建方法及其應用技術領域。
背景技術：
口蹄疫(foot-and-mouth disease, FMD),是由口蹄疫病毒(foot-and-mouthdisease virus,FMDV)引起的以侵害偶蹄動物為主的急性、熱性、高度接觸性人畜共患傳染病，在國際上受到高度重視。該病毒屬于小RNA病毒科FMDV屬，有O型，A型，C型，SAT I型，SAT II型，SATIII型及Asia I型等7個血清型，70多個亞型，各型之間無交叉反應。流行病學調查和實驗感染證明，有100多種動物可以感染。口蹄疫已被世界動物衛生組織(world organization of animal health, 0ΙΕ)列為 A 類動物傳染病之首。( 一 ) 口蹄疫的發生和危害:口蹄疫的發生早在五六百年前就已經有記載，在14-15世紀就有類似口蹄疫的牛病的描述。最早對于口蹄疫發生和流行的描述，應追溯到1546年,意大利學者GirolamoFracastor較為詳細地記錄了 1514年在意大利Friul1、Venice、Verona等地先后暴發口蹄疫的情況。自意大利發生口蹄疫以來，口蹄疫在歐洲大陸流行了幾百年，17-18世紀，口蹄疫在法國、意大利、德國 、瑞士、奧地利等國經常大規模流行。英國也在1839年發生了口蹄疫。此后歐洲在1845-1894年之間均有口蹄疫的廣泛流行。1991年保加利亞發生了一次規模較大的疫情。2001年口蹄疫在英國流行，同年9月歐洲各國聲稱口蹄疫在歐洲已經被消滅，然而在2007年8月英國由于實驗室管道泄漏，再次出現口蹄疫。根據聯合國糧農組織(foodand agriculture organization of the UnitedNation, FA0)和OIE發表的家畜衛生年鑒統計資料，1951-1953年亞洲每年都曾發生口蹄疫的大流行，1959年亞洲有16個國家或地區發生口蹄疫，1977年有13個，1979年多達30個，1982-1983年有27個，1984年有16個，1985年有10個，1987年又上升為22個，1989年仍有17個國家或地區流行口蹄疫。到了 90年代后，亞洲口蹄疫疫情更為嚴峻。最嚴重的是1997年和2000年中國臺灣和日本、韓國暴發大規模口蹄疫，損失嚴重。中北美國家是世界上最早消滅口蹄疫的國家和地區，美國于1929年、加拿大于1952年、墨西哥于1954年宣布消滅口蹄疫。此前美國歷史上口蹄疫曾發生了 9次，墨西哥在1926年和1946年曾2次暴發口蹄疫，經過采取許多周密而有效的措施撲滅了疫情。南美國家口蹄疫的疫情較為嚴重，多年來造成很大的經濟損失。不過經過南美各國在防制方面的努力，1981年智利宣布為無口蹄疫國家；到90年代，OIE曾將烏拉圭、阿根廷、巴拉圭、巴西劃為“疫苗免疫的無口蹄疫國家或地區”。幾年之后，口蹄疫又入侵阿根廷南部地區，只有智利一直保持著無口蹄疫國家的地位。口蹄疫的發生和流行對當地的發展有著巨大的危害，以我國臺灣地區1997年3月的疫情為例。這場口蹄疫風暴前后歷時3個多月，共波及6147個養豬場，1011674頭豬發病，184231頭豬死亡，撲殺了 600萬頭豬，直接經濟損失高達15.52億美元，相關行業的間接經濟損失為62.08億美元，國民經濟總產值損失達104.76億美元。( 二)RNAi技術在抗病毒上的應用:由于病毒的入侵，很有可能造成宿主細胞的復制、代謝及其它正常生理功能受到影響，甚至使宿主細胞死亡，最終導致宿主的發病乃至死亡。目前抵抗和消除病毒感染給宿主帶來的不良后果，主要依賴于抗病毒的藥物和干擾素，然而病毒為了生存會在進化中不斷形成新的耐藥性，而且某些藥物和干擾素對動物機體會產生很大的副作用。RNAi能阻斷病毒感染途徑，或抑制其作用過程中關鍵蛋白質的表達，是對抗病毒感染最有效的方式。因此，RNAi的出現給抗病毒研究提供了新思路，為病毒病治療帶來了新希望。然而，科學家們至今已針對FMDV不同基因在細胞和動物等不同水平對RNAi抗FMDV效果進行了研究和探索。據報道，在長期使用SiRNA抑制病毒復制的治療過程中會使病毒基因變異而產生RNAi抗性，導致病毒逃逸。而為了解決這一問題，人們開始針對病毒基因組保守區或同時以不同基因序列作為靶基因。
發明內容
本發明的目的在于公開了 一種多個抗口蹄疫shRNA串聯表達載體，利用該多個抗口蹄疫shRNA串聯表達載體可生產轉基因動物，用于對現有普通品種進行改良從而提高易感物種對口蹄疫病毒的抵抗力，在一定程度上減少口蹄疫帶來的經濟損失。本發明的另一個目的在于公開了多個抗口蹄疫shRNA串聯表達載體的構建方法。本發明的第三個目的在于公開了多個抗口蹄疫shRNA串聯表達載體的應用。本發明的目的是通過以下技術方案實現的:—種多個抗口蹄疫shRNA串聯表達載體,其中,所述表達載體為載體一或載體二，其中載體一為 pbu7SK-Consl-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-CMV-EGFP-LoxP ;或載體二為LV-bu7SK-Consl-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-CMV-EGFP-LoxP0上述技術方案所述的一種多個抗口蹄疫shRNA串聯表達載體，其中，多個抗口蹄疫shRNA串聯表達載體中Consl如序列I所示；Cons2如序列2所示；Cons3如序列3所示。上述技術方案所述的多個抗口蹄疫shRNA串聯表達載體的構建方法，包括下述步驟:(I)、根據GenBank中口蹄疫病毒3B和3D基因的高保守區，化學合成3個shRNA串聯的 Consl-Cons2-Cons3 片段，連入 pMD_18T 載體，得到 pl8T-Consl-Cons2-Cons3-LoxP載體；其中Consl-Cons2-Cons3中在Consl的5’端設有XbaI\SacI雙酶切位點，在Consl和Cons2之間設有Clal/Xhol雙酶切位點，在Cons2和Cons3之間設有BglII\MluI雙酶切位點，在Cons3的3’端設有LoxP\NotI雙酶切位點；(2)、以水牛基因組為模板，以SEQ N0.4/SEQ N0.5為引物擴增出水牛7SK的啟動子bu7SK ;以水牛基因組為模板，以SEQ N0.6/SEQ N0.7為引物擴增出水牛U6的啟動子buU6 ;以牛基因組為模板，以SEQ N0.8/SEQ N0.9為引物擴增出牛U6的啟動子boU6 ；(3)、對步驟⑵中得到的啟動子片段和步驟⑴得到的載體分別進行雙酶切后連接，依次將啟動子bu7SK、啟動子buU6和啟動子boU6連入步驟(I)的pl8T-Consl-Cons2-Cons3_LoxP 載體中，得到載體 pl8T-bu7SK-Consl-buU6-Cons2-boU6_Cons3-LoxP ；(4)、用 Xbal/Notl 雙酶切載體 pl8T-bu7SK-Consl-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LοχΡ,得到 Xba1-bu7SK-Consl-buU6-Cons2-boU6-Cons3_LoxP-NotI ；以慢病毒載體質粒pSicoR為載體骨架，用Xbal/Notl雙酶切載體骨架后，用T4連接酶將Xba1-bu7SK_Consl-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-NotI 連接入 Xbal/Notl 雙酶切后的 pSicoR 質粒中，得到多個抗口蹄疫 shRNA 串聯表達載體一 pbu7SK-Consl-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-CMV-EGFP-LoxP ；(5)、將載體一與慢病毒包裝質粒pNRF和pVsvg在293T細胞中共轉染，得到載體二 LV-bu7SK-Consl-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-CMV-EGFP-LoxP。上述技術方案所述多個抗口蹄疫shRNA串聯表達載體的構建方法，其中，步驟(3)具體方法如下:(a)、首先用內切酶 Xbal/SacI 將 pl8T-Consl-Cons2-Cons3-LoxP 切開，將 bu7SK啟動子用 T4 連接酶連接至 Consl 的 5’ 端，得到 pl8T-bu7SK-Consl-Cons2-Cons3-LoxP ；(b)、其次用內切酶 Clal/Xhol 將 Pl8T-1xi7SK-Consl-Cons2-Cons3-LoxP 切開，將buU6 啟動子用 T4 連接酶連接至 Cons2 的 5’端，得到 pl8T-bu7SK-Consl-buU6-Cons2_Cons3-LoxP ；(c)、最后用內切酶Mlul/Bglll 將 pI8T-1xi7SK-Consl-buU6-Cons2-Cons3_LoxP 切開，將boU6啟動子用T4連接酶連接至Cons3的5’端，得到pl8T-bu7SK-Consl-buU6_Cons2-boU6-Cons3_LoxP。上述技術方案所述的多個抗口蹄疫shRNA串聯表達載體在檢測由該載體表達的shRNA抑制口蹄疫病毒復制方面的應用或者在構建轉基因小鼠方面的應用。
上述技術方案所述的應用，其中，檢測步驟為:用載體二轉染BHK-21細胞獲得轉基因細胞BHK-LV，用O型口蹄疫病毒分別感染轉基因細胞BHK-LV和非轉基因BHK-21細胞，在不同時間點通過實時定量PCR測定病毒拷貝數，以制作病毒復制曲線，將轉基因細胞BHK-LV與非轉基因BHK-21細胞的病毒復制曲線做比較，確定多個抗口蹄疫shRNA串聯表達載體二在BHK細胞中對口蹄疫病毒復制的抑制作用。上述技術方案所述的應用，其中，所述應用為在小鼠上進行對載體表達的shRNA抑制口蹄疫病毒復制的檢測；本技術方案的具體操作方法為:用所述載體二注射到乳鼠頸后皮下，24h后再頸后皮下注射不同滴度的O型口蹄疫病毒，在不同時間點觀察乳鼠死亡情況，確定多個抗口蹄疫shRNA串聯表達載體二在乳鼠中對口蹄疫病毒抵抗作用。上述技術方案所述的應用，其中，所述應用為在轉基因乳鼠上進行對載體表達的shRNA抑制口蹄疫病毒復制的檢測；本技術方案的具體操作方法為:頸后皮下注射不同滴度的O型口蹄疫病毒，在不同時間點觀察乳鼠死亡情況，確定多個抗口蹄疫shRNA串聯表達載體一在轉基因乳鼠中對口蹄疫病毒抵抗作用。本發明具有以下有益效果:本發明利用水牛7SK、U6及牛U6啟動子串聯表達針對口蹄疫病毒基因的3個shRNA，構建了多個抗口蹄疫shRNA串聯表達載體及慢病毒表達載體，用慢病毒載體生產抗口蹄疫的轉基因細胞及嵌合體小鼠，并采用原核注射法，將非慢病毒多個抗口蹄疫shRNA串聯表達載體轉入動物基因組中，使轉基因動物對口蹄疫病毒有一定抵抗能力，建立了抗口蹄疫轉基因動物。通過對抗口蹄疫轉基因細胞和嵌合體小鼠的分析檢測，確定細胞中有shRNA的表達，且轉基因細胞對口蹄疫病毒的復制有明顯抑制作用，嵌合體乳鼠對口蹄疫病毒也具有明顯的抵抗力。通過對抗口蹄疫轉基因乳鼠的分析檢測，確定轉基因乳鼠對口蹄疫病毒有一定抵抗力，尤其是在LD50滴度上相比普通乳鼠，死亡率較低。本發明通過多個針對口蹄疫病毒不同保守區的shRNA在細胞和動物體內進行表達，既能有效減少口蹄疫病毒的免疫逃逸，又能達到廣譜抑制口蹄疫病毒的效果。因此，應用本發明可望通過轉基因家畜的制備，對現有普通品種進彳丁改良從而提聞易感物種對口蹄疫病毒的抵抗力，在一定程度上減少口蹄疫帶來的經濟損失。
:1、圖1為pl8T_3shRNA質粒啟動子酶切鑒定電泳圖；2、圖2為載體一酶切鑒定圖；3、圖 3 為載體一目的片段 bu7SK-Consl-buU6-Cons2-boU6-Cons3_LoxP 測序圖；4、圖 4 為多個抗口蹄疫 shRNA 串聯表達載體一 pbu7SK-Consl-buU6-Cons2_boU6-Cons3-LoxP-CMV-EGFP-LoxP 的結構圖；5、圖5為包裝慢病毒載體轉染后72h熒光細胞照片；6、圖6為圖5的常光照片；7、圖7為純化后慢病毒滴度測定時第八孔熒光照片；8、圖8為圖7的常光照片；9、圖9為生產的轉基因細胞BHK-LV的熒光照片；
10、圖10為圖9的常光照片；11、圖11是應用莖-環法進行實時定量PCR檢測3個抗口蹄疫shRNA在轉基因細胞BHK-LV中的表達圖；12、圖12是FMDV在轉基因細胞BHK-LV中的復制曲線；13、圖13是經載體二慢病毒載體預處理后的乳鼠對口蹄疫病毒的抵抗力檢測圖；14、圖14為F2代轉基因小鼠與普通小鼠交配獲得F3代后代PCR檢測；15、圖15為F2代轉基因小鼠之間交配獲得F3代后代PCR檢測；16、圖16是轉基因乳鼠對口蹄疫病毒的抵抗力檢測結果圖；17、圖17是接種口蹄疫病毒72h后，轉基因小鼠各組織病毒含量測定結果圖。
具體實施方式
:為使本發明的技術方案便于理解，以下結合具體試驗例對本發明所述的多個抗口蹄疫shRNA串聯表達載體、該表達載體的構建方法以及該表達載體的應用作進一步的說明。一、實驗材料和方法所用載體、細胞系和試劑來源:pMD18T載體(購自Takara公司)，pSicoR、pNRF和pVsvg載體由本實驗室保存，Consl-Cons2-Cons3-LoxP序列合成由南京金斯瑞公司完成，水牛7SK、U6和牛U6啟動子由發明人自行克隆。引物合成以及序列測定由上海生工有限公司完成，Taq酶、T4DNA連接酶、內切酶、QRT-PCR相關試劑均購自Takara公司，小提質粒以及膠回收試劑盒購自TIANGEN公司，去內毒小提質粒試劑盒購自OMEGA公司，細胞轉染以及胞質內注射用外源基因膠回收試劑盒購自QIAGEN公司，293T細胞系為申請人保存，BHK-21細胞系由中國農科院蘭州獸醫研究所提供，細胞、乳鼠用口蹄疫病毒由中國農科院蘭州獸醫研究所提供。所用基因組提取、總RNA提取、PCR擴增、反轉錄、酶切、膠回收、連接、轉化、質粒提取、脂質體轉染法、顯微注射法、QRT-PCR等實驗操作步驟詳見《分子克隆(第三版)》(2000年，科學出版社)或相應的試劑盒說明書。轉基因小鼠的生產由廣州賽業公司代理。實施例1:抗口蹄疫shRNA設計和多個抗口蹄疫shRNA串聯表達載體及慢病毒載體的構建:根據NCBI上公布的各血清型口蹄疫的全基因組序列(AF189157、AY304994、AY593751和AF274010)，利用BLAST軟件進行多重序列比對，在3B和3D基因中選擇三段保守區域:(1)3B 區域中 5，-CCT GTC GCT TTG AAA GTG AAA GC-3，位于 4900_4922nt ； (2) 3D區域中 5，-GAG ATT CCA AGC TAC AGA TCA CTT TAC CTG CGT TGG GTG MC GCC GTG TGCGGTGAC GC-3，位于 6934-6992nt ； (3) 3D 區域中 5，-GAC GAG TAC CGG CGT CTC TTTGAG CC-3，位于6892-6917nt。三段根據口蹄疫病毒基因組中3B和3D保守區域設計的shRNA的雙鏈DNA序列如序列表1-3所示，其中Consl為序列1，Cons2為序列2，Cons3為序列3 ；化學合成3 個 shRNA 串聯的片段 Consl-Cons2_Cons3,其中 Consl-Cons2_Cons3 中在Consl的5’端設有XbaI\SacI雙酶切位點，在Consl和Cons2之間設有Clal/Xhol雙酶切位點，在Cons2和Cons3之間設有BglII\MluI雙酶切位點，在Cons3的3’端設有LoxP\NotI雙酶切位點，該片段包含酶切位點的完整序列為EcoRl-Xbal-Sacl-Consl-Cla1-Xho1-Cons2-Bgl I 1-Mlu1-Cons3-LoxP-Not 1-HindI II ;經 EcoRI/Hindl 11 雙酶切，連入 pMD_18T 載體構建成P18T-Consl-Cons2-Cons3-LoxP，酶切體系如表I所示，T4連接體系如表5所示:。表I EcoRI/Hindlll 酶切體系`(IX)
權利要求
1.一種多個抗口蹄疫ShRNA串聯表達載體,其特征在于:所述表達載體為載體一或載體二，其中載體一為 pbu7SK-Consl-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-CMV-EGFP-LoxP ;或載體二為 LV-bu7SK-Consl-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-CMV-EGFP-LoxP。
2.根據權利要求1所述的一種多個抗口蹄疫shRNA串聯表達載體，其特征在于:多個抗口蹄疫shRNA串聯表達載體中Consl如序列I所示；Cons2如序列2所示；Cons3如序列3所示。
3.權利要求1或2所述的多個抗口蹄疫shRNA串聯表達載體的構建方法，包括下述步驟: (1)、根據GenBank中口蹄疫病毒3B和3D基因的高保守區，化學合成3個shRNA串聯的 Consl-Cons2-Cons3 片段，連入 pMD_18T 載體，得到 pl8T-Consl-Cons2-Cons3-LoxP 載體；其中Consl-Cons2-Cons3中在Consl的5’端設有XbaI\SacI雙酶切位點，在Consl和Cons2之間設有Clal/Xhol雙酶切位點，在Cons2和Cons3之間設有BglII\MluI雙酶切位點，在Cons3的3’端設有LoxP\NotI雙酶切位點； (2)、以水牛基因組為模板，以SEQN0.4/SEQ N0.5為引物擴增出水牛7SK的啟動子bu7SK ;以水牛基因組為模板，以SEQ N0.6/SEQ N0.7為引物擴增出水牛U6的啟動子buU6 ；以牛基因組為模板，以SEQ N0.8/SEQ N0.9為引物擴增出牛U6的啟動子boU6 ； (3)、對步驟⑵中得到的啟動子片段和步驟⑴得到的載體分別進行雙酶切后連接，依次將啟動子bu7SK、啟動子buU6和啟動子boU6連入步驟(I)的pl8T-Consl-Cons2-Cons3_LoxP 載體中，得到載體 pl8T-bu7SK-Consl-buU6-Cons2-boU6_Cons3-LoxP ；(4)、用Xbal/Notl 雙酶切載體 pl8T-bu7SK-Consl-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP，得到 Xba1-bu7SK-Consl-buU6-Cons2-boU6-Cons3_LoxP-NotI ；以慢病毒載體質粒 pSicoR 為載體骨架，用Xbal/Notl雙酶切載體骨架后，用T4連接酶將Xba1-bu7SK-Consl-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-NotI連接入Xbal/Notl雙酶切后的pSicoR質粒中，得到多個抗口蹄疫shPRNA 串聯表達載體一 pbu7SK-Consl-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-CMV-EGFP-LoxP ； (5)、將載體一與慢病毒包裝質粒pNRF和pVsvg在293T細胞中共轉染，得到載體二LV-bu7SK-Consl-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-CMV-EGFP-LoxP0
4.根據權利要求3所述多個抗口蹄疫shRNA串聯表達載體的構建方法，其特征在于，步驟(3)具體方法如下: (a)、首先用內切酶Xbal/SacI 將 pl8T-Consl-Cons2-Cons3-LoxP 切開，將 bu7SK 啟動子用 T4 連接酶連接至 Consl 的 5’ 端，得到 pl8T-bu7SK-Consl-Cons2-Cons3-LoxP ； (b)、其次用內切酶Clal/Xhol 將 pl8T-bu7SK-Consl-Cons2-Cons3-LoxP 切開，將 buU6啟動子用 T4 連接酶連接至 Cons2 的 5’ 端，得到 pl8T-bu7SK-Consl-buU6-Cons2-Cons3-LoxP ; (c)、最后用內切酶Mlul/Bglll 將 pl8T-bu7SK-Consl-buU6-Cons2-Cons3-LoxP 切開，將boU6啟動子用T4連接酶連接至Cons3的5’端，得到pl8T-bu7SK-Consl-buU6-Cons2_boU6-Cons3-LoxP。
5.由權利要求1或2所述的多個抗口蹄疫shRNA串聯表達載體在檢測由該載體表達的shRNA抑制口蹄疫病毒復制方面的應用或者在構建轉基因小鼠方面的應用。
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，檢測步驟為:用載體二轉染BHK-21細胞獲得轉基因細胞BHK-LV，用O型口蹄疫病毒分別感染轉基因細胞BHK-LV和非轉基因BHK-21細胞，在不同時間點通過實時定量PCR測定病毒拷貝數，以制作病毒復制曲線，將轉基因細胞BHK-LV與非轉基因BHK-21細胞的病毒復制曲線做比較，確定多個抗口蹄疫shRNA串聯表達載體二在BHK細胞中對口蹄疫病毒復制的抑制作用。
7.根據權利要求5所述的應用，其中，所述應用為在小鼠上進行對載體表達的shRNA抑制口蹄疫病毒復制的檢測。
8.根據權利要求7所述的檢測，其特征在于:用所述載體二注射到乳鼠頸后皮下，24h后再頸后皮下注射不同滴度的O型口蹄疫病毒，在不同時間點觀察乳鼠死亡情況，確定多個抗口蹄疫shRNA串聯表達載體二在乳鼠中對口蹄疫病毒抵抗作用。
9.根據權利要求5所述檢測方法，其中，所述應用為在轉基因乳鼠上進行對載體表達的shRNA抑制口蹄疫病毒復制的檢測。
10.根據權利要求9所述的檢測，其特征在于:頸后皮下注射不同滴度的O型口蹄疫病毒，在不同時間點觀察乳鼠死亡情況，確定多個抗口蹄疫shRNA串聯表達載體一在轉基因乳鼠中對口蹄疫病 毒抵抗作用。
全文摘要
本發明一種多個抗口蹄疫shRNA串聯表達載體、其構建方法及其應用，屬于基因工程、病毒學領域。本發明構建了多個抗口蹄疫shRNA串聯表達載體，并利用慢病毒介導方法將該載體轉入BHK-21細胞中獲得對口蹄疫病毒復制有抑制作用的轉基因細胞，后將該慢病毒載體注入動物皮下，獲得抗口蹄疫嵌合體動物。此外，利用多個抗口蹄疫shRNA串聯表達載體制備出抗口蹄疫轉基因小鼠，對O型口蹄疫病毒具有一定抗性，在5LD50病毒滴度下乳鼠的存活率獲得明顯提高。因此，應用本發明可望通過抗口蹄疫轉基因家畜的制備，對現有普通品種進行改良從而提高易感物種對口蹄疫病毒的抵抗力，在一定程度上減少口蹄疫帶來的經濟損失。
文檔編號C12Q1/68GK103184235SQ20131008910
公開日2013年7月3日 申請日期2013年3月20日 優先權日2013年3月20日
發明者石德順, 張曉溪, 崔奎青, 劉慶友, 李湘萍 申請人:廣西大學