熱休克蛋白47膠質瘤相關腫瘤抗原及應用的制作方法
【專利摘要】本發明屬于生物制藥領域，涉及熱休克蛋白47膠質瘤相關腫瘤抗原，具體涉及熱休克蛋白47作為與預后相關的惡性膠質瘤特異性腫瘤抗原以及所述抗原的兩個CTL表位及其九肽氨基酸序列，和所述CTL表位誘導T細胞反應用于臨床預后判定，及其在制備惡性膠質瘤免疫治療疫苗中的用途。本發明通過qPCR和蛋白免疫印跡的方法，證實熱休克蛋白47在膠質母細胞瘤上高表達；同時驗證了CTL表位與臨床預后的相關性，本發明的熱休克蛋白47膠質瘤相關腫瘤抗原可進一步制備包含該抗原的組合物和化合物及制備免疫治療的制劑，用于判定惡性膠質瘤預后和免疫治療。
【專利說明】熱休克蛋白47膠質瘤相關腫瘤抗原及應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物制藥領域，涉及熱休克蛋白47膠質瘤相關腫瘤抗原，更具體地， 涉及熱休克蛋白47作為與預后相關的惡性膠質瘤特異性腫瘤抗原以及所述抗原的兩個 CTL表位及其九肽氨基酸序列，及其所述CTL表位誘導T細胞反應用以臨床預后判定，及其 在制備惡性膠質瘤免疫治療疫苗中的用途。
【背景技術】
[0002] 現有技術公開了膠質瘤（glioma)是中樞神經系統最常見的腫瘤，其中惡性膠質 瘤（WHO III、IV級）治愈率低，復發率高，預后極差，尤其是對于IV級的膠質母細胞瘤 (glioblastoma，GBM)患者。臨床實踐顯示，由于大多數膠質瘤呈浸潤性生長，與正常組織無 明顯分界，所以單靠手術無法根治。目前，對于GBM推薦標準治療方案，即手術后同步放化 療加6個療程的替莫唑胺（TMZ)化療，其平均生存期僅為12-15個月。因此，對于惡性膠質 瘤，尋找更有效的治療方法是目前臨床急需解決的難題。目前免疫治療，尤其是利用自身T 細胞殺傷顯微手術后殘留的腫瘤細胞，得到了業內極大的關注。
[0003] 熱休克蛋白（heat shock protein, HSP)是進化上高度保守的蛋白，其功能涉及細 胞生物學的各個方面。HSP目前分成如下六類：HsplOO, Hsp90, Hsp70, Hsp60, Hsp40和小分 子HSP。就免疫的角度而言，HSP本身可以作為抗原，或者作為抗原呈遞的輔佐分子。研究 顯示，HSP可以綁定抗原肽從而呈遞給抗原呈遞細胞（antigen presentation cell, APC)。 癌癥細胞上的HSP肽復合物能夠激發自身的適應性和固有免疫系統。國際專利公布號 W02009/117116EN熱休克蛋白GP96的疫苗接種及其使用方法中，公開了被基因修飾以 表達編碼分泌形式的熱休克蛋白（hsp) gp96多肽的核酸的腫瘤細胞。該HSP-96肽疫苗已經 安全地用于GBM患者的臨床治療（Crane CA, etal. Clin Cancer Res, 2013; 19:205-214.)。
[0004] HSP47,亦稱SERPINH1或者colligin2,作為膠原特定的分子伴侶，其參與各種膠 原前蛋白成熟的各個過程。對于膠質瘤而言，目前有關HSP47的文獻報道中，涉及HSP47在 膠質瘤血管上的表達（Mustafa D，et al.fcain Pathol, 2010;20:50-65. );HSP47 參與了膠 質瘤新生血管的發生發展（Mustafa DA, et al.Molecular&cellular proteomics:MCP, 200 7;6:1147-1157.)。迄今，尚未見HSP47作為惡性膠質瘤相關抗原或者其他腫瘤的相關抗原 的報道。
[0005] 表位是抗原分子中可與CTUTh和B細胞表面受體結合，誘導特異性細胞免疫和體 液免疫，進而產生免疫保護作用的一段氨基酸序列。有研究提出，通過篩選富含多個CTL、 Th和B細胞優勢表位的氨基酸序列為抗原，可達到既能誘導免疫應答又可減少免疫病理反 應的目的；能夠有效增強表位提呈的效率，解決表位疫苗的免疫原性弱目的。膠質瘤相關抗 原的T細胞表位能誘導T細胞反應從而殺傷腫瘤細胞，在已報道的膠質瘤相關抗原中，涉及 1'細胞表位的有下列基因 ：3六町-1，5六1?1'-3，11-13代(3印如四2(*3111，1^41，6六1^3，頂-2，￡ phA2, EGFRvIII, HER-2, gplOO, MAGE-1, gBK, TRP-2, Sox2, Soxll, Sox6, HSD3B7 等。其相應的 T細胞表位如表1所示。
[0006] 表1膠質瘤相關抗原的表位肽
[0007] Author Year Gene name HLA classification Amino Acid position Sequence
[0008]
【權利要求】
1. 熱休克蛋白47 (HSP47)在制備判定惡性膠質瘤預后與免疫治療的制劑中的用途。
2. 按權利要求1所述的用途，其中用于惡性膠質瘤預后判定的是檢測HSP47特異性T 細胞免疫應答，T細胞免疫應答陽性者預后好、陰性者預后差。
3. 按權利要求2所述的用途，其中檢測T細胞免疫應答為針對HSP47的部分序列，包括 但不限于： (a) HSP47 上第 184-192 位氨基酸序列 KLPEVTKDV ; (b) HSP47上第3-11位氨基酸序列LLLLSAFCL。
4. 按權利要求2或3所述的用途，其中用于檢測T細胞免疫應答的方法為基于 IFN-ga_a的ELISPOT法、基于流式技術的IFN-ga_a細胞內染色法、Tetramer流式檢測法 以及其他T細胞免疫應答的定量方法；按所述的每種方法的特定要求判定T細胞免疫應答 的陽性與陰性。
5. 按權利要求1的用途，其中所述的免疫治療的制劑是免疫治療惡性膠質瘤的治療性 疫苗。
6. 按權利要求5所述的用途，其中所述的治療性疫苗為DNA、病毒載體、細菌載體或蛋 白亞單位疫苗。
7. 按權利要求5或6所述的用途，其特征在于，所述的治療性疫苗包括但不限于下述序 列： (a) HSP47 上第 184-192 位氨基酸序列 KLPEVTKDV ; (b) HSP47上第3-11位氨基酸序列LLLLSAFCL。
【文檔編號】G01N33/68GK104374918SQ201310362324
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2013年8月17日 優先權日:2013年8月17日
【發明者】吳哲褒, 徐建青, 周良輔, 仇超, 蔡霖, 林紹堅 申請人:復旦大學