專利名稱：一種腫瘤－胎盤抗原蛋白及其dna在腫瘤治療中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種腫瘤抗原蛋白質及其編碼DNA的用途，特別是涉及一種腫瘤-胎盤抗原蛋白及其DNA在制備用于治療肝癌、腸癌、胃癌和肺癌的藥物中的應用。
背景技術：
惡性腫瘤是成脅人類健康的一大類疾病。腫瘤的發生是一個非常復雜的過程。腫瘤細胞能夠發生和進展的一個重要因素在于其能夠逃避機體免疫系統的監視作用，因此，如何激發和喚起機體的免疫系統識別并排斥“非己”成分的腫瘤細胞是尋找新的腫瘤治療方法的一個突破口。在對腫瘤的免疫治療研究的初期，人們發展了很多辦法來激發機體的免疫系統來排斥“非己”成分的腫瘤細胞，盡管這些方法在動物腫瘤模型的治療上取得了很好的療效，但是在人類腫瘤的治療上仍缺乏顯著的效果。
已知人體內的免疫系統，包括體液免疫與細胞免疫，尤其是T細胞免疫對腫瘤的殺傷抑制起著重要作用。隨著人們對免疫應答反應本質的認識，人們發現不管免疫應答的過程多么復雜，最終導致T細胞活化而產生殺傷效應的就是與主要組織相容性復合體MHC相結合形成抗原肽復合物和共刺激信號，即細胞毒性T細胞(CTL)通過自身表面的T細胞受體(TCR)，識別表達于腫瘤細胞表面的腫瘤抗原蛋白質/肽與主要組織相容性復合體(MHC)I類抗原相結合形成的復合體，從而攻擊殺傷腫瘤細胞。
腫瘤抗原蛋白質/肽的產生是由腫瘤細胞先表達成腫瘤抗原，其在細胞內由各種蛋白酶分解成8～10個氨基酸大小的抗原肽，這些抗原肽與同時在內質網中產生MHC I類分子結合，通過高爾基復合體表達于細胞的表面，最終提呈給腫瘤抗原特異的CTL，從而誘發免疫應答，殺傷清除腫瘤細胞。這種存在于腫瘤細胞中、能與MHC分子結合并誘發機體免疫反應的蛋白質抗原分子即為腫瘤抗原。可以用這些抗原誘導機體產生只針對腫瘤細胞的免疫應答反應，從而特異殺傷體內的腫瘤細胞而達到治療或者防治腫瘤細胞轉移的作用。因此近幾十年來，人們把用免疫方法治療腫瘤的重點放在尋找腫瘤特異和/或相關性抗原上。
在二十世紀五十年代，Foley等人把經化學誘變產生腫瘤的小鼠用滅活的自身腫瘤細胞免疫后，再給該小鼠接種活的腫瘤細胞，這些腫瘤細胞被排斥而不能生長成腫瘤，小鼠則存活；與之對照，沒用滅活的自身腫瘤細胞免疫的小鼠接種活的腫瘤細胞后，腫瘤細胞不被排斥而生長成腫瘤，小鼠則死亡。此實驗以令人信服的證據證明了化學誘變的腫瘤存在腫瘤特異性抗原，但是這種保護反應有著精確的特異性，即只針對相同類型的腫瘤而不針對不同類型的腫瘤，即使是對用同一致癌劑在同一小鼠上誘導的不同類型腫瘤也沒有保護作用。
1991年，T.Boon等首次從人黑色素瘤細胞中鑒定出腫瘤抗原蛋白質，并命名為MAGE(科學，2541643-1647，1991)。隨后，人們又鑒定出來其它一些腫瘤抗原蛋白質，可以分為腫瘤-睪丸(CT)抗原蛋白質、分化抗原蛋白質、突變的腫瘤抗原蛋白質、過表達的腫瘤抗原蛋白質和病毒抗原蛋白質五類。其中，應用于臨床上最為廣泛的是腫瘤-睪丸(CT)抗原蛋白質。
腫瘤-睪丸(CT)抗原蛋白質是目前鑒定的腫瘤抗原中最多的一類，它們編碼基因的特點是在很多類型的腫瘤中都有表達，如在黑色素瘤、肺癌、肉瘤和膀胱癌中都有表達，但在除睪丸外的正常組織都不表達，在胎盤、卵巢、胰腺中有一定量的表達。因為睪丸是免疫特許部位，所以這一類抗原在治療上被認為是腫瘤特異性的抗原，是最有希望用作為腫瘤免疫治療用途的一類抗原。目前試用于臨床上的也主要就是這一類抗原，如MAGE-1和NY-ESO-1即是在一定類型的腫瘤中有高陽性率的表達，又有很好的免疫原性的抗原蛋白質，用于腫瘤的免疫治療時有很好的前景。同時也有一些腫瘤抗原蛋白質在除胎盤外的任何正常組織中都不表達，即使在睪丸中也不表達，胎盤是只有孕婦才有的組織，從腫瘤免疫治療應用的角度，這一類抗原在人體具有與腫瘤-睪丸抗原相似的性質，因此也可以歸類為腫瘤-睪丸抗原或直接稱為腫瘤-胎盤抗原。
到目前為止，最具代表性的鑒定腫瘤抗原蛋白質的方法為基于特異性細胞免疫應答基礎上的文庫篩選法、基于體液免疫應答基礎上的cDNA表達文庫篩選法、組合肽文庫篩選、酸洗脫法和生物信息學方法。
肝癌、腸癌、胃癌和肺癌是人類腫瘤中最為常見的惡性腫瘤，尤其是近些年來，發病率逐漸增加。這些腫瘤生長迅速，即使發現也難以治愈，目前，主要的治療方法是傳統的手術切除和放療等局部治療，但由于大部分患者確診時腫瘤已經難以控制，并且對放療與化療有相當的抵抗性。因此治療的效果和預后往往較差，病人的一年與五年存活率是很低的。尋找治療方法上的突破或者是新的治療方法一直是臨床腫瘤學家追求的目標，人們期待著有新的方法來提高腫瘤的早期診斷與病人良好的預后，以及術后清除體內殘留的腫瘤細胞和防止腫瘤細胞的轉移。
發明內容
本發明的目的在于提供一種腫瘤抗原蛋白質在制備用于治療癌癥的藥物中的應用。
本發明的另一目的在于提供一種編碼腫瘤抗原蛋白質的DNA序列在制備用于治療癌癥的藥物中的應用。
本發明的目的是通過如下的技術方案實現的本發明提供了一種腫瘤抗原蛋白質在制備用于治療癌癥的藥物中的應用，該蛋白質具有如下(a)或(b)所述的氨基酸序列(a)具有圖7所示的氨基酸序列；(b)將(a)中的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代，缺失或添加突變所產生的衍生蛋白質，且該衍生蛋白質與(a)的蛋白質具有相同的功能。
本發明的這種腫瘤抗原蛋白質通過細胞內分解，能產生與主要組織相容性復合體(MHC)-I類分子相結合的、在結合狀態能被T細胞所識別的肽片段，激發免疫反應而達到治療癌癥的目的。
本發明的腫瘤抗原蛋白質在制備用于治療癌癥的藥物時，優選為治療肝癌、腸癌、胃癌或肺癌。本發明的腫瘤抗原蛋白質還可作為腫瘤-胎盤抗原而制成疫苗。
另一方面，本發明還提供了一種編碼腫瘤抗原蛋白質的DNA序列在制備用于治療癌癥的藥物中的應用，其中所編碼的腫瘤抗原蛋白質具有如下(a)或(b)所述的氨基酸序列(a)具有序列1所示的氨基酸序列；(b)將(a)中的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代，缺失或添加突變所產生的衍生蛋白質，且該衍生蛋白質與(a)的蛋白質具有相同的功能。
優選所述的DNA在基因文庫中登錄號為CP1，BC022335，如序列表中SEQ ID No1所示的核苷酸序列。
優選所述的DNA序列用于治療肝癌、腸癌、胃癌或肺癌。本發明的DNA還可作為腫瘤-胎盤基因，用于制備疫苗。
本發明的優益之處在于本發明首次將CP1基因鑒定為腫瘤-胎盤抗原基因；在使用免疫方法治療癌癥時，可以用本發明的腫瘤抗原蛋白質誘導機體產生只針對腫瘤細胞的免疫應答反應，從而在不殺傷正常細胞的同時，特異殺傷體內的腫瘤細胞而達到治療或者防治腫瘤細胞轉移的作用；同時，可以通過對該腫瘤抗原基因或抗體的檢測，對腫瘤的發生、發展以及是否有轉移進行診斷。
應用本發明的腫瘤抗原蛋白質可以提供活化抗腫瘤免疫的醫藥、可提供腫瘤的診斷方法。抗本發明的腫瘤抗原蛋白質的抗體可用于親和層析、cDNA文庫的篩選、免疫學診斷或醫藥的制備。
圖1是編碼本發明抗原蛋白質的基因PLAC1在16種成人正常組織的RT-PCR檢測結果；其中泳道1～16依次分別代表成人正常組織脾、前列腺、卵巢、小腸、胎盤、大腸、白細胞、睪丸、心臟、肺、肝、腦、腎、骨骼肌、胰腺和胸腺。
圖2是編碼本發明抗原蛋白質的基因PLAC1在肝癌的癌組織與配對的癌旁組織的RT-PCR結果其中Ca代表肝癌組織，Adj代表配對的癌旁組織。
圖3是編碼本發明抗原蛋白質的基因PLAC1在肝癌組織與配對的癌旁組織的Northern blot結果其中的Ca代表肝癌組織，Adj代表配對的癌旁組織。
圖4是CP1基因重組蛋白質在大腸桿菌中的表達結果其中的N代表沒有誘導；1與2代表誘導重組蛋白質表達的大腸桿菌全蛋白，與N比較，在23kD的位置上出現一條蛋白帶；3與4代表誘導重組蛋白質表達的大腸桿菌用包涵體洗滌液洗滌后的結果；5與6代表用抗重組蛋白帶有的6個組氨酸的單克隆抗體，通過Western雜交方法，對重組蛋白進行鑒定的結果；箭頭所示為在大腸桿菌中表達的CP1基因重組蛋白質。
圖5是通過ELISA方法檢測的本發明抗原蛋白質免疫家兔產生的多克隆抗體的結果其中 分別代表免疫三只不同的家兔產生的三份不同的血清； 代表作為陰性對照的沒有用本發明抗原蛋白質免疫的家兔的血清。
圖6是通過免疫組織化學的方法檢測的本發明抗原蛋白質在胃癌組織中表達的結果其中箭頭所示為檢測到的本發明抗原蛋白質。
圖7本發明腫瘤抗原蛋白質的氨基酸序列。
具體實施例方式
實施例1、肝癌中差異表達cDNA片斷PLAC1的發現為了篩選原發性肝細胞癌中差異表達的基因，我們利用Clontech公司的抑制消減雜交技術(suppression subtractive hybridization，SSH)試劑盒(PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit)，采用抑制消減雜交技術，以肝癌組織作為檢測者(tester)，相應的癌旁組織作為驅趕者(driver)，進行了抑制消減雜交。
首先以TRIzol試劑盒(Gibco公司)提取肝癌及癌旁組織總RNA，采用Promega公司PolyATract mRNA分離試劑盒(Promega，Madison，WI)分離mRNA，紫外分光光度檢測mRNA的濃度和純度。
SSH操作流程按試劑盒說明，以2μg mRNA合成cDNA第一鏈及第二鏈，繼而用RsaI酶消化雙鏈cDNA，酚/氯仿抽提純化cDNA片斷，testercDNA分為兩份，分別與兩種接頭(adaptor)于16℃連接過夜，取1μl連接產物稀釋于200μl水中，檢測連接效率。將連接有不同接頭的tester雙鏈DNA各1.5μl分別與1.5μl driver雙鏈DNA及1μl 4×雜交液98℃變性1.5分鐘，68℃雜交8小時。然后混合兩份雜交樣品及過量的新鮮變性的driver，68℃雜交16小時。雜交結束后加入200μl稀釋液稀釋后作為模板，進行兩輪PCR擴增(引物PCR引物15’CTA ATA CGACTC ACT ATA GGG C 3’；巢式PCR引物15’TCG AGC GGC CGCCCG GGC AGG T 3’；巢式PCR引物2R5’AGC GTG GTC GCGGCC GAG GT 3’)，第一次PCR循環參數為75℃5分鐘，30循環94℃30秒，66℃30秒，72℃1.5分鐘。將第一輪PCR產物1∶10稀釋后，取1μl作模板進行巢式PCR(nested PCR)15循環94℃10秒，68℃30秒，72℃1.5分鐘。各取第一、二次PCR產物8μl用2％瓊脂糖凝膠電泳進行分析。用試劑盒提供的G3PDH(甘油醛3-磷酸脫氫酶)5’及3’引物按試劑盒說明檢測消減雜交效率。
將第二輪PCR產物按常規方法克隆入pGEM-T Easy vector，轉化入感受態E.coli TOP10F’菌，構成消減文庫，隨機挑選克隆，提取質粒后用EcoR I酶切鑒定插入片斷大小，選取有大小不同的片斷，送上海基康公司測序，所得結果用Blast軟件與GenBank中的核酸序列進行同源比對，結果其中的一個片斷是一個已知的胎盤特異基因PLAC1的一部分。因此，我們發現PLAC1也在肝癌組織中表達。
實施例2、用RT-PCR的方法來證明PLAC1基因在肝癌、腸癌、胃癌和肺癌的表達生物技術公司CLONTECH的16種商品化的人正常組織的cDNA(脾、前列腺、睪丸、卵巢、小腸、大腸、白細胞、心臟、肺、肝、腦、腎、胰腺、胎盤、骨骼肌、胸腺)、來源于39例肝癌病人的癌組織與配對的癌旁組織的cDNA、來源于24例腸癌病人的癌組織與配對的癌旁組織的cDNA、來源于24例胃癌病人的癌組織與配對的癌旁組織的cDNA、與來源于24例肺癌病人的癌組織與配對的癌旁組織的cDNA被用來檢測PLAC1基因在正常組織與腫瘤組織的表達情況。
本發明中進行RT-PCR的條件應用CLONTECH公司的advanced熱啟動DNA聚合酶，94℃15秒；65℃30秒；72℃、40秒，30循環，之后，72℃、6分鐘。進行RT-PCR的引物序列，正向引物ctg ttc ctg gcaccc tgt gca tcc；反向引物gat gcc gcc atg ctg ttc acc c。結果發現PLAC1基因在50％的肝癌標本、36％的腸癌、50％的胃癌與40％的肺癌中表達，而與之配對的癌旁組織都不表達；在16種成人重要正常組織中，PLAC1基因僅在胎盤組織中表達(圖1、圖2)。本實施例證明腫瘤-胎盤抗原基因PLAC1在各種腫瘤組織中廣泛表達，我們依據現在已知的PLAC1基因全面的性質將其重新命名為CP1(基因文庫中登錄號為CP1，BC022335)。
實施例3、用Northern雜交的方法來分析CP1基因在肝癌、腸癌、胃癌與肺癌腫瘤組織中的表達用TRIZOL試劑(PROMEGA)從腫瘤病人的癌組織與配對的癌旁組織中提取總RNA，接著應用mRNA分離試劑盒(PROMEGA)從總RNA中分離mRNA。在甲酰胺、甲醛存在的條件下將2ug的mRNA變性，進行瓊脂糖電泳后轉到Hybond-N+尼龍膜(Amersham)上，用紫外交聯的方法固定。用地高辛DNA探針標記試劑盒(Roche)標記實施例2中擴增出來的DNA片段，以制作DNA探針，按照常規的Northern雜交方法與膜上的mRNA進行雜交，之后進行放射自顯影，檢測出本發明中的腫瘤-胎盤抗原蛋白質基因CP1的mRNA。然后，將檢測出該基因mRNA所用的膜在1％SDS溶液中煮沸，除掉地高辛標記的探針后，用標記的管家基因G3PDH作探針，用同樣的方法進行Northern雜交，檢測出的mRNA作陽性對照。結果表明，本發明的腫瘤抗原蛋白質基因的mRNA僅在肝癌、腸癌、胃癌與肺癌的癌組織中表達，而配對的癌旁組織不表達(圖3)。與腫瘤-胎盤抗原基因的特性一致。
實施例4、CP1基因重組蛋白質在大腸桿菌中的表達應用pQE30原核表達載體(購于INVOTRIGEN公司)，構建表達腫瘤-胎盤抗原CP1的質粒pQE30-CP1，該質粒在大腸桿菌菌株M15(購于INVOTRIGEN公司)中，37℃生長條件下，IPTG誘導重組蛋白質表達6小時。SDS-PAGE蛋白電泳對重組蛋白的表達進行鑒定。之后，應用鎳離子親和層析柱子(購于INVOTRIGEN公司)將重組蛋白質從大腸桿菌全蛋白中分離、純化出來。用抗重組蛋白帶有的6個組氨酸的單克隆抗體(購于INVOTRIGEN公司)，通過Westem雜交方法，對重組蛋白進行鑒定(圖4)。結果在預期大小的23kD位置上有預期的蛋白，以抗6個組氨酸的單克隆抗體進行的Western雜交證實了表達的蛋白就是CP1基因的重組蛋白。
實施例5、用Western雜交方法檢測肝癌、腸癌、胃癌與肺癌腫瘤病人血清中的抗CP1重組蛋白的抗體參照實驗醫學雜志，1871349，1998中的方法，篩選CP1 mRNA轉錄本陽性的腫瘤病人的血清，發現在腫瘤(肝癌、腸癌、胃癌與肺癌)病人的血清中存在抗CP1重組蛋白的抗體。因此，CP1是一個新的腫瘤-胎盤抗原，具有誘導腫瘤病人產生免疫應答，排斥殺傷腫瘤細胞的能力，有應用于腫瘤的臨床免疫治療的潛能。
實施例6、人工抗CP1重組蛋白多克隆抗體的制備參照分子克隆實驗指南，第二版(黎孟楓、金冬雁譯)852，第十八章的第一、二節中的方法，以純化的CP1重組蛋白免疫3只家兔4次，第一次免疫后1個月進行第二次免疫，第二次與第三次免疫、第三次與第四次免疫之間間隔2周，第四次免疫后兩周收獲家兔的血清，抗CP1重組蛋白的多克隆抗體就在這些血清中。將多克隆抗體在1∶500稀釋之后，再依次進行3倍的系列稀釋，通過ELISA方法，對多克隆抗體進行鑒定。結果顯示三只家兔產生的多克隆抗體都能夠與CP1重組蛋白發生特異性的反應，而且多克隆抗體的滴度是很高的(圖5)。
實施例7、用免疫組織化學的方法檢測肝癌、腸癌、胃癌與肺癌病人腫瘤組織中天然的CP1抗原蛋白質的存在參照實驗室調查(LABORATORY INVESTIGATION)雜志，831，2003中的方法，用純化的人工抗CP1重組蛋白多克隆抗體，進行免疫組織化學實驗，檢測肝癌、腸癌、胃癌與肺癌病人腫瘤組織中是否存在天然的CP1抗原蛋白質，結果發現在這些腫瘤組織中存在天然的CP1蛋白，該蛋白定位在細胞核內。圖6顯示了CP1抗原蛋白質在胃癌的表達結果。因此，CP1作為一個新的腫瘤-胎盤抗原，在腫瘤組織中的確存在該抗原，這為CP1應用于腫瘤的臨床免疫治療提供了進一步的依據。
實施例8、突變的腫瘤抗原蛋白質的制備及其血清抗體篩選參照分子克隆實驗指南，第二版(黎孟楓、金冬雁譯)693，第十五章中的方法，制備了如下隨機突變的DNA，將序列號2中的第361個堿基由A突變為G，由此也就將序列號1中的第24個氨基酸由S突變為G；將序列號2中的第661個堿基由C突變為A，由此也就將序列號1中的第124個氨基酸由L突變為I。將突變的兩個DNA分別克隆到表達載體中，表達突變的腫瘤抗原，詳細參照實施例4。應用制備的突變的腫瘤抗原參照實施例5篩選腫瘤病人的血清，發現在腫瘤病人的血清中也存在著這些突變腫瘤抗原的抗體。由于該實施例中的突變位點是隨機選定的，這說明在腫瘤病人的血清中也存在針對其它位點的突變產生的腫瘤抗原蛋白質的抗體。該實施例說明突變的腫瘤抗原也有誘導腫瘤病人產生免疫應答，排斥殺傷腫瘤細胞的能力，有應用于腫瘤的臨床免疫治療的潛能。
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權利要求
1.一種腫瘤抗原蛋白質在制備用于治療癌癥的藥物中的應用，該蛋白質具有如下(a)或(b)所述的氨基酸序列(a)具有圖7所示的氨基酸序列；(b)將(a)中的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代，缺失或添加突變所產生的衍生蛋白質，且該衍生蛋白質與(a)的蛋白質具有相同的功能。
2.根據權利要求1所述的蛋白質的應用，其特征在于所述的癌癥為肝癌、腸癌、胃癌或肺癌。
3.根據權利要求1所述的蛋白質的應用，其特征在于所述的藥物為所述的蛋白質作為腫瘤-胎盤抗原而制得的疫苗。
4.一種編碼腫瘤抗原蛋白質的DNA序列在制備用于治療癌癥的藥物中的應用，其中所編碼的腫瘤抗原蛋白質具有如下(a)或(b)所述的氨基酸序列(a)具有序列1所示的氨基酸序列；(b)將(a)中的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代，缺失或添加突變所產生的衍生蛋白質，且該衍生蛋白質與(a)的蛋白質具有相同的功能。
5.根據權利要求4所述的DNA的應用，其特征在于所述的DNA序列為基因文庫中登錄號為CP1，BC022335。
6.根據權利要求4所述的DNA的應用，其特征在于所述的癌癥為肝癌、腸癌、胃癌或肺癌。
7.根據權利要求4所述的DNA的應用，其特征在于所述的藥物為所述的DNA作為腫瘤-胎盤基因而制得的疫苗。
全文摘要
本發明涉及一種腫瘤－胎盤抗原蛋白在制備用于治療癌癥的藥物中的應用。本發明進一步涉及編碼該腫瘤－胎盤抗原蛋白的DNA序列在制備用于治療癌癥的藥物中的應用。本發明的腫瘤抗原蛋白及其基因對腫瘤的治療，腫瘤的發生、發展以及是否有轉移的診斷提供了一種新的途徑。
文檔編號A61K39/00GK1663603SQ20041000608
公開日2005年9月7日 申請日期2004年3月2日 優先權日2004年3月2日
發明者陳慰峰, 董學員, 龐學雯 申請人:北京大學