牛羊布魯氏菌病間接酶聯免疫吸附試驗抗體檢測試劑盒及其制備方法
【專利摘要】牛羊布魯氏菌病間接酶聯免疫吸附試驗抗體檢測試劑盒及其制備方法，屬于人畜共患傳染病病原體的檢測領域，解決了現有采用其他抗原檢測布魯氏菌存在敏感性低、特異性差的問題，該試劑盒是以SUMO為表達載體在大腸桿菌BL21中誘導表達的重組布魯氏菌BCSP31蛋白為抗原包被酶標板，加入待檢血清、兔抗牛HRP-IgG或兔抗羊HRP-IgG，并配以洗滌緩沖液、封閉液、TMB底物溶液和終止液組裝而成。本發明利用原核表達載體SUMO在大腸桿菌BL21中高效可溶地表達了布魯氏菌BCSP31蛋白，用于布魯氏菌ELISA檢測方法的建立，檢測的重復性、特異性較好，利用此方法可以快速有效的檢測牛羊布魯氏菌。
【專利說明】牛羊布魯氏菌病間接酶聯免疫吸附試驗抗體檢測試劑盒及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及人畜共患傳染病病原體的檢測【技術領域】，具體涉及一種牛羊布魯氏菌病間接酶聯免疫吸附試驗抗體檢測試劑盒及其制備方法。
【背景技術】
[0002]布魯氏菌表面蛋白31(Brucella cellsurface protein31ku,BCSP31)基因于 1988年被克隆測序和體外表達，它編碼了大小為31ku具有免疫原性的可溶性細胞表面蛋白質，除了綿羊附睪布魯氏菌外，在其他6種布魯氏菌中均可檢測到BCSP31蛋白的表達。布魯氏菌BCSP31基因在8株不同屬來源的布魯氏菌菌株中同源性達99.3%，是布魯氏菌種屬特異性基因，具有高度保守性。
[0003]目前，已有學者利用真核表達的方法表達了BCSP31蛋白，并利用其真核表達產物免疫小鼠，研究其在小鼠體內的抗布魯氏菌感染的能力；也有學者利用原核表達載體pGEX4p-l表達了 BCSP31蛋白，并研制了 BCSP31蛋白的單克隆抗體。
[0004]目前，布魯氏菌PCR快速分子生物學診斷方法的建立通常是基于布魯氏菌BCSP31基因的克隆，獲得特異性的目的片段進行診斷布魯氏菌病。然而，目前利用布魯氏菌BCSP31蛋白作為抗原建立布魯氏菌病血清學診斷方法還沒有報道。
【發明內容】
[0005]為了解決現有采用其他抗原檢測牛羊布魯氏菌病存在的敏感性低、特異性不高的問題，本發明提供一種牛羊布魯氏菌病間接酶聯免疫吸附試驗抗體檢測試劑盒及其制備方法，本發明利用BCSP31蛋白作為抗原建立了牛羊布魯氏菌病間接ELISA抗體檢測方法，并研制了相應的檢測試劑盒。
[0006]本發明為解決技術問題所采用的技術方案如下:
[0007]牛羊布魯氏菌病間接酶聯免疫吸附試驗抗體檢測試劑盒，該試劑盒是以SUMO為表達載體在大腸桿菌BL21中誘導表達的重組布魯氏菌BCSP31蛋白作為抗原包被酶標板，分別加入待檢血清和二抗，并配以洗滌緩沖液、封閉液、TMB底物溶液和終止液組裝而成，所述二抗為兔抗牛HRP-1gG或兔抗羊HRP-1gG。
[0008]所述抗原的制備方法如下:
[0009](I)布魯氏菌BCSP31蛋白的表達、純化及檢測
[0010]①根據GenBank公布的牛種布魯氏菌BCSP31蛋白序列設計引物:
[0011]上游引物P1:5 ’ -TGACCTGCTAGTAGGTATGAAATTCGGAAGCA-3 ’，
[0012]下游引物P2:5’ -TGTCTAGATTATTTCAGCACGCCCGCT-3’ ；
[0013]②分別以羊種布魯氏菌標準菌株16M、羊種布魯氏菌疫苗株M5及牛種布魯氏菌標準菌株544A的基因組DNA為模板，PCR擴增BCSP31基因片段；
[0014]③將PCR產物純化后連于Blunt載體上進行克隆轉化，獲得BCSP31克隆質粒；[0015]④選擇SUMO載體為表達載體，用BfuAI和XbaI分別酶切測序比對正確的BCSP31克隆質粒和SUMO空載體質粒；
[0016]⑤回收酶切產物，用T4連接酶連接，16°C過夜，構建SUM0-BCSP31重組表達質粒；
[0017]⑥將獲得的SUM0-BCSP31重組表達質粒轉入大腸桿菌DH5 α感受態細胞，篩選陽性克隆，獲得陽性克隆質粒；
[0018]⑦將陽性克隆質粒轉入大腸桿菌BL21進行誘導表達，終濃度為ImM的IPTG誘導6h后，超聲裂解菌體，離心收取上清和沉淀，所表達的BCSP31蛋白在細胞上清中；
[0019]⑧將上述細胞上清經鎳柱純化，再用BCA法測定純化的BCSP31蛋白的濃度，在53kDa處得到單一目的條帶。
[0020]⑨將獲得的重組的布魯氏菌BCSP31蛋白凍干保存。
[0021]所述洗滌緩沖液為PBST溶液，其配制方法為:稱取磷酸二氫鉀0.2g，磷酸氫二鈉
2.9g，氯化鈉8.0g，氯化鉀0.2g，用雙蒸水溶解至IOOOmL,再加入ImL吐溫20，混勻，得到PBST溶液。
[0022]所述封閉液的配制方法為:稱取磷酸二氫鉀0.2g，磷酸氫二鈉2.9g，氯化鈉8.0g,氯化鉀0.2g，用雙蒸水溶解至IOOOmL,再加入ImL吐溫20，混勻，得到PBST溶液，量取PBST溶液IOOml，加入2%BSA，搖勻，得到封閉液。
[0023]所述終止液為2mol/L的硫酸溶液，其配制方法為:量取蒸餾水178.3ml，逐滴加入98%的濃硫酸21.7ml，得到終止液。
[0024]制備牛羊布魯氏菌病間接酶聯免疫吸附試驗抗體檢測試劑盒的方法，該方法的條件和步驟如下:
[0025]( I)抗原包被酶標板
[0026]包被:以在大腸桿菌BL21感受態細胞中誘導表達的重組布魯氏菌BCSP31蛋白為抗原，用抗原稀釋液稀釋純化的凍干抗原，得到濃度為119μ g/mL的抗原稀釋液，每孔加入100 μ L抗原稀釋液,包被酶標板，4°C過夜，
[0027]洗滌:棄掉抗原溶液，每孔加入300 μ L洗滌緩沖液洗滌，重復洗滌三次，每次3?5min，
[0028]封閉:將酶標板置于濾紙上拍干至無水為止，每孔加入100 μ L封閉液，37°C孵育I ?2h,
[0029]洗滌:棄掉封閉液，每孔加入300 μ L洗滌緩沖液洗滌，重復洗滌三次,每次3?5min ；
[0030](2) —抗孵育
[0031]用抗體稀釋液按待檢血清:抗體稀釋液=1: 80的比例稀釋待檢血清，
[0032]將酶標板置于濾紙上拍干至無水為止，每孔加入100 μ L經過稀釋的待檢血清，37 °C溫箱中孵育I?2h，
[0033]洗滌:棄掉待檢血清，每孔加入300 μ L洗滌緩沖液洗滌，重復洗滌三次,每次3?5min ；
[0034]( 3 )酶標二抗的孵育
[0035]用抗體稀釋液按照兔抗牛HRP-1gG:抗體稀釋液=1: 5000的比例稀釋兔抗牛HRP-1gG，用抗體稀釋液按照兔抗羊HRP-1gG:抗體稀釋液=1: 8000的比例稀釋兔抗羊HRP-1gG,
[0036]將酶標板置于濾紙上拍干至無水為止，每孔加入IOOyL經過稀釋的兔抗牛HRP-1gG或兔抗羊HRP-1gG，37°C溫箱中孵育1~2h，
[0037]洗滌:棄掉兔抗牛HRP-1gG或兔抗羊HRP-1gG，每孔加入300 μ L洗滌緩沖液洗滌，重復洗滌三次，每次3~5min ；
[0038](4)顯色
[0039]將酶標板置于濾紙上拍干至無水印為止，每孔加入50 μ L新鮮的TMB底物溶液，37°C溫箱中孵育10~15min ；
[0040](5)終止
[0041]每孔加入50 μ L終止液即2mol/L的硫酸溶液終止反應，
[0042]終止反應后，迅速采用酶聯免疫檢測儀測定酶標板的OD45tlnm值，當OD45tlnm值≥0.433時判為陽性，OD450nm值≤0.366時判為陰性。
[0043]所述抗原稀釋液為pH=9.6,0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液，其配制方法為:稱取碳酸鈉1.59g，碳酸氫鈉2.93g，混合，用雙蒸水溶解至1000mL,于4°C儲存，備用，保存時間不超過I個月。
[0044]所述抗體稀釋液為含有1%BSA的PBST溶液，其配制方法為:稱取磷酸二氫鉀
0.2g，磷酸氫二鈉2.9g，氯化鈉8.0g和氯化鉀0.2g，量取ImL吐溫20，混合，用雙蒸水溶解至1000mL,加入1%BSA，搖勻，得到抗體稀釋液。
[0045]所述洗滌緩沖液為PBST溶液，其配制方法為:稱取磷酸二氫鉀0.2g，磷酸氫二鈉
2.9g，氯化鈉8.0g,氯化鉀0.2g，用雙蒸水溶解至1000mL,再加入ImL吐溫20，混勻，得到PBST溶液。
[0046]所述封閉液為含有2%BSA的PBST溶液，其配制方法為:稱取磷酸二氫鉀0.2g，磷酸氫二鈉2.9g，氯化鈉8.0g,氯化鉀0.2g，用雙蒸水溶解至1000mL,再加入ImL吐溫20，混勻，得到PBST溶液，量取PBST溶液100ml，加入2%BSA，搖勻，得到封閉液。
[0047]本發明的有益效果是:本發明的試劑盒是利用重組的布魯氏菌BCSP31蛋白為抗原，利用ELISA檢測方法組裝的，基于對布魯氏菌BCSP31蛋白免疫原性的分析，結果表明其可以作為布魯氏菌ELISA檢測方法很好的候選抗原，用于布魯氏菌ELISA檢測方法的建立，檢測的敏感性、特異性、重復性較好；
[0048]本發明的試劑盒的制備方法中，利用原核表達載體SUMO在大腸桿菌BL21中高效可溶地表達了布魯氏菌BCSP31蛋白，并對其反應原性和免疫原性進行了檢測，并將其用于布魯氏菌病間接ELIISA抗體檢測試劑盒的研制，采用的抗原稀釋液以及抗體稀釋液對抗原和抗體按照最佳稀釋比進行稀釋，并且采用最佳濃度的抗原包被酶標板，使得最終得到的試劑盒具有重復性和特異性較好的效果，利用此方法可以快速有效的檢測牛羊布魯氏菌，比利用其他抗原的試劑盒具有更好的檢測效果。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0049]圖1為SUM0-BCSP31重組質粒在大腸桿菌BL21中的誘導表達結果圖，圖1中:M為蛋白1&^1?^，1、2、3和4均為誘導表達的重組此5?31蛋白；
[0050]圖2為誘導的SUM0-BCSP31重組蛋白在細胞上清中的表達結果圖，圖2中:1和2均為細胞上清產物，3和4均為細胞沉淀產物；
[0051]圖3為重組蛋白SUM0-BCSP31經鎳柱純化結果圖，圖3中:M為蛋白Marker，1、2和3均為鎳柱洗脫產物,4為鎳柱結合后剩余產物；
[0052]圖4為小鼠血清抗體效價檢測結果圖；
[0053]圖5為小鼠血清亞型IgGl和IgG2aELISA檢測結果圖。
【具體實施方式】
[0054]一、材料來源
[0055]1、(I)羊種布魯氏菌標準菌株16M (B.melitensisl6M)、羊種布魯氏菌疫苗株M5(B.melitensis M5)、牛種布魯氏菌標準菌株544A (B.abortus544A)、牛/羊布魯氏菌病陽性血清和牛/羊布魯氏菌病陰性血清均購自中國獸藥監察所；
[0056](2)IPTG購自Sigma公司，貨號為16758 ;TMB (3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺)底物溶液購自sigma公司，貨號為T0440 ;1%BSA (牛血清白蛋白)購自sigma公司，貨號為A1933 ;2%BSA (牛血清白蛋白)均購自sigma公司，貨號為A1933 ;兔抗牛HRP-1gG (抗牛二抗)為兔抗牛辣根過氧化物酶標記的IgG，購自sigma公司，貨號為A5295 ;兔抗羊HRP-1gG (抗羊二抗)為兔抗羊辣根過氧化物酶標記的IgG，購自sigma公司，貨號為SAB3700257 ；
[0057](3) Blunt載體和T4連接酶均購自NEB公司；
[0058](4) SUMO 載體購自 Invitrogen 公司；
[0059](5)大腸桿菌DH5a感受態細胞和大腸桿菌BL21購自北京全式金公司，保存在-80°C冰箱中；
[0060](6)酶標板為聚苯乙烯96孔板,購自美國Costar公司；
[0061](7)大腸桿菌陽性血清、沙門氏菌陽性血清、巴氏桿菌陽性血清和鏈球菌陽性血清均由中國農業科學院特產研究所保存。
[0062]2、本發明中的抗原稀釋液為pH=9.6,0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液，主要成分為碳酸鈉和碳酸氫鈉，其具體配制方法為:稱取碳酸鈉1.59g，碳酸氫鈉2.93g，混合，用雙蒸水溶解至IOOOmL,于4°C儲存，備用，保存時間不超過I個月。
[0063]3、本發明中的洗滌緩沖液為PBST溶液，其具體配制方法為:稱取磷酸二氫鉀(KH2PO4) 0.2g，磷酸氫二鈉(Na2HPO4.Iffi2O) 2.9g，氯化鈉(NaCl) 8.0g，氯化鉀(KCl) 0.2g，用雙蒸水溶解至IOOOmL,再加入ImL吐溫20，混勻，得到PBST溶液。
[0064]4、本發明中的封閉液為含有2%BSA的PBST溶液，其配制方法為:稱取磷酸二氫鉀(KH2PO4) 0.2g，磷酸氫二鈉(Na2HPO4.Iffi2O) 2.9g，氯化鈉(NaCl) 8.0g，氯化鉀(KCl) 0.2g，用雙蒸水溶解至IOOOmL,，再加入ImL吐溫20，混勻，得到PBST溶液，量取PBST溶液100ml，加入2%BSA，搖勻，得到封閉液。
[0065]5、待檢血清(一抗)為臨床上采集的牛/羊血清，其具體制備方法如下:用促凝管采集牛/羊血液5ml，37°C放置30min，4°C放置2h，3000rpm,離心15min，析出的血清收集在EP管中，于_20°C儲存，備用。
[0066]6、本發明中的抗體稀釋液為含有1%BSA (牛血清白蛋白)的PBST溶液，其具體配制方法為:稱取磷酸二氫鉀(KH2PO4) 0.2g，磷酸氫二鈉(Na2HPO4.12H20) 2.9g，氯化鈉(NaCl)
8.0g和氯化鉀(KCl) 0.2g，用雙蒸水溶解至IOOOmL,再加入ImL吐溫20，混勻，加入1%BSA(牛血清白蛋白)，搖勻，得到抗體稀釋液。
[0067]7、本發明中的終止液為2mol/L的硫酸溶液，其具體配制方法為:量取蒸餾水178.3ml，逐滴加入98%的濃硫酸21.7ml。
[0068]8、制備抗原
[0069](I)布魯氏菌BCSP31蛋白的表達、純化及檢測
[0070]①根據GenBank公布的牛種布魯氏菌BCSP31蛋白序列設計引物:
[0071]上游引物Pl:5’ -TGACCTGCTAGTAGGTATGAAATTCGGAAGCA-3’，
[0072]下游引物P2:5 ’ -TGTCTAGATTATTTCAGCACGCCCGCT-3 ’ ；
[0073]②分別以羊種布魯氏菌標準菌株16M (B.melitensisl6M)、羊種布魯氏菌疫苗株M5 (B.melitensis M5)及牛種布魯氏菌標準菌株544A (B.abortus544A)的基因組DNA為模板，PCR擴增BCSP31基因片段；
[0074]③將PCR產物純化后連于Blunt載體上進行克隆轉化，獲得BCSP31克隆質粒；
[0075]④選擇SUMO載體為表達載體，用BfuAI和XbaI分別酶切測序比對正確的BCSP31克隆質粒和SUMO空載體質粒，SUMO空載體質粒可以高效的誘導可溶性表達，增加表達量，表達后的蛋白全部是可溶性的蛋白；
[0076]⑤回收酶切產物，用T4連接酶連接，16°C過夜，構建SUM0-BCSP31重組表達質粒；
[0077]⑥將獲得的SUM0-BCSP31重組表達質粒轉入大腸桿菌DH5 α感受態細胞，篩選陽性克隆，獲得陽性克隆質粒；
[0078]⑦將陽性克隆質粒轉入大腸桿菌BL21進行誘導表達，終濃度為ImM的IPTG(異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷)誘導6h后，超聲裂解菌體，離心收取上清和沉淀，分別進行SDS-PAGE分析(聚丙烯酰氨凝膠電泳)，檢測可溶性蛋白的表達，SDS-PAGE分析結果如圖1所示，1、2、3和4均為誘導表達的重組BCSP31蛋白，可溶性蛋白的表達結果如圖2所示，所表達的BCSP31蛋白在細胞上清中；
[0079]⑧將上述細胞上清經鎳柱(GE-Healthcare，貨號28_4020_89)純化，再用BCA法測定純化的BCSP31蛋白的濃度，細胞上清經鎳柱純化的結果如圖3所示，在53kDa處得到單一目的條帶。
[0080]⑨將獲得的重組的布魯氏菌BCSP31蛋白凍干保存。
[0081](2)重組的布魯氏菌BCSP31蛋白免疫原性的檢測及分析
[0082]分別利用臨床上采集的布魯氏菌陽性血清，重組的BCSP31蛋白免疫小鼠后血清進行免疫印跡分析(Western-blotting)檢測其反應原性和抗原性，并檢測重組的BCSP31蛋白免疫小鼠后血清中的IgGl和IgG2a的分泌水平。
[0083]①ELISA檢測小鼠血清IgG
[0084]將免疫后小鼠每隔7天尾尖采血，直到免疫后第8周，收集血清，間接酶聯免疫吸附檢測免疫后小鼠血清抗體效價，結果如圖4所示，表達有免疫重組菌SUM0-BCSP31的大腸桿菌BL21從免疫后第7天開始，血清效價逐漸上升，直到免疫后第8周還沒有下降，最高血清效價為1: 5600。
[0085]②小鼠血清IgG亞型的檢測
[0086]利用ELISA檢測試劑盒檢測小鼠血清IgGl和IgG2a的表達量，結果如圖5所示，免疫重組菌SUM0-BCSP31的小鼠誘導產生的IgG亞型是以IgGl為主，說明該免疫重組菌SUM0-BCSP31誘導了 TH2型免疫反應，以血清抗體免疫為主，羊種布魯氏菌疫苗株M5則同時誘導產生IgGl和IgG2a，說明布魯氏菌弱毒疫苗株能夠同時刺激機體產生細胞免疫反應和體液免疫反應，而PBS對照組則無明顯的IgGl和IgG2a產生。
[0087]二、牛羊布魯氏菌病間接酶聯免疫吸附試驗抗體檢測試劑盒的組成
[0088]該試劑盒是以SUMO為表達載體在大腸桿菌BL21中誘導表達的重組布魯氏菌BCSP31蛋白作為抗原包被酶標板，分別加入待檢血清、二抗(兔抗牛HRP-1gG或兔抗羊HRP-1gG),并配以洗滌緩沖液、封閉液、TMB底物溶液和終止液組裝而成。
[0089]三、牛羊布魯氏菌病間接酶聯免疫吸附試驗抗體檢測試劑盒的制備方法
[0090]將重組的BCSP31蛋白經純化后作為抗原包被ELISA板，采用方陣滴定法進行最佳抗原和抗體濃度的確定，并對ELISA進行最佳檢測條件的優化，確定最佳抗原包被濃度、一抗和二抗作用時間及濃度，并確定最佳判定標準，并對ELISA的敏感性、特異性、重復性進行檢測，最后對新建的ELISA檢測方法進行臨床初步應用并與傳統的方法進行了對比性實驗。
[0091]本發明的牛羊布魯氏菌病間接酶聯免疫吸附試驗抗體檢測試劑盒的制備方法，該方法的條件和步驟如下:
[0092]1、抗原包被酶標板
[0093](I)包被:以在大腸桿菌BL21中誘導表達的重組布魯氏菌BCSP31蛋白為抗原，用抗原稀釋液稀釋純化的凍干抗原，得到濃度為119 μ g/mL的抗原稀釋液，每孔加入100 μ L抗原稀釋液，包被酶標板，4°C過夜，
[0094](2)洗滌:棄掉抗原溶液，每孔加入300 μ L洗滌緩沖液洗滌，重復洗滌三次，每次3 ?5min，
[0095](3)封閉:將酶標板置于濾紙上拍干至無水為止，每孔加入100 μ L封閉液，37°C孵育I?2h,
[0096](4)洗滌:棄掉封閉液，每孔加入300 μ L洗滌緩沖液洗滌，重復洗滌三次，每次3?5min ；
[0097]2、一抗孵育
[0098](I)用抗體稀釋液按照待檢血清(一抗):抗體稀釋液=1: 80的比例稀釋待檢血清，
[0099](2)將酶標板置于濾紙上拍干至無水印為止，每孔加入100 μ L經過稀釋的待檢血清，37°C溫箱中孵育I?2h，
[0100](3)洗滌:棄掉待檢血清，每孔加入300 μ L洗滌緩沖液洗滌，重復洗滌三次,每次3 ?5min ；
[0101]3、酶標二抗的孵育
[0102](I)用抗體稀釋液按照兔抗牛HRP-1gG:抗體稀釋液=1: 5000的比例稀釋兔抗牛HRP-1gG (抗牛二抗)，用抗體稀釋液按照兔抗羊HRP-1gG:抗體稀釋液=1: 8000的比例稀釋兔抗羊HRP-1gG (抗羊二抗)，
[0103](2)將酶標板置于濾紙上拍干至無水印為止，每孔加入100 μ L經過稀釋的兔抗牛HRP-1gG或兔抗羊HRP-1gG，37°C溫箱中孵育I?2h，
[0104](3)洗滌:棄掉兔抗牛HRP-1gG或兔抗羊HRP-1gG，每孔加入300 μ L洗滌緩沖液洗滌，重復洗滌三次，每次3~5min ；
[0105]4、顯色
[0106]將酶標板置于濾紙上拍干至無水印為止，每孔加入50 μ L新鮮的TMB底物溶液，37°C溫箱中孵育10~15min ；
[0107]5、終止
[0108](I)每孔加入50 μ L終止液終止反應，
[0109](2)終止反應后，迅速采用酶聯免疫檢測儀測定酶標板的OD45tlnm值，當OD45tlnm值≥0.433時判為陽性，OD450nm值≤0.366時判為陰性。
[0110]本發明的牛羊布魯氏菌病間接酶聯免疫吸附試驗抗體檢測試劑盒的制備方法中反應條件的確定如下:
[0111]1、抗原抗體最佳濃度的確定
[0112]利用方陣滴定法對重組的BCSP31蛋白即抗原的最佳包被濃度及待檢血清的最佳稀釋度進行篩選，結果顯示，當抗原的包被濃度為119 μ g/mL，待檢血清的稀釋倍數為1:80時，陽性血清OD45tlnm值可達到2.056，而陰性血清的OD45tol值為0.208。
[0113]2、ELISA陰陽性臨界值的確定結果
[0114]通過對40份牛布魯氏菌病陰性血清進行間接ELISA測定，其平均值X為0.232，標準差SD為0.067，即當樣本OD45tol值≤X + 3SD=0.232+0.134=0.433時判為陽性，當樣本OD45tlnm值≤X + 2SD=0.232+2X0.067=0.366時判為陰性，樣品OD45tlnm值處于兩者之間判為可疑。
[0115]實施例1特異性試驗
[0116]利用已確定的ELISA反應條件，組裝牛羊布魯氏菌病間接酶聯免疫吸附試驗抗體檢測試劑盒，以重組的BCSP31蛋白抗原包被酶標板，大腸桿菌陽性血清、沙門氏菌陽性血清、巴氏桿陽性血清菌、鏈球菌陽性血清進行ELISA檢測分析交叉試驗，以及牛布魯氏菌病陽性血清、陰性血清各一份作對照。結果如表1所示:大腸桿菌陽性血清、沙門氏菌陽性血清、巴氏桿陽性血清菌、鏈球菌陽性血清的OD45tol值均小于0.366，因此，這幾種細菌陽性血清在該ELISA反應體系下均為陰性，而牛布魯氏菌病陽性血清的OD45tlnm值大于0.433，由此表明本發明的試劑盒的特異性較好。
[0117]表1
[0118]
【權利要求】
1.牛羊布魯氏菌病間接酶聯免疫吸附試驗抗體檢測試劑盒，其特征在于， 該試劑盒是以SUMO為表達載體在大腸桿菌BL21中誘導表達的重組布魯氏菌BCSP31蛋白作為抗原包被酶標板，分別加入待檢血清和二抗，并配以洗滌緩沖液、封閉液、TMB底物溶液和終止液組裝而成，所述二抗為兔抗牛HRP-1gG或兔抗羊HRP-1gG。
2.根據權利要求1所述的牛羊布魯氏菌病間接酶聯免疫吸附試驗抗體檢測試劑盒，其特征在于，所述抗原的制備方法如下: (I)布魯氏菌BCSP31蛋白的表達、純化及檢測 ①根據GenBank公布的牛種布魯氏菌BCSP31蛋白序列設計引物:
上游引物 P1:5’ -TGACCTGCTAGTAGGTATGAAATTCGGAAGCA-3’，
下游引物卩2:5’ -TGTCTAGATTATTTCAGCACGCCCGCT-3’ ； ②分別以羊種布魯氏圃標準圃株16M、羊種布魯氏圃疫苗株M5及牛種布魯氏圃標準圃株544A的基因組DNA為模板，PCR擴增BCSP31基因片段； ③將PCR產物純化后連于Blunt載體上進行克隆轉化，獲得BCSP31克隆質粒； ④選擇SUMO載體為表達載體，用BfuAI和XbaI分別酶切測序比對正確的BCSP31克隆質粒和SUMO空載體質粒； ⑤回收酶切產物，用T4連接酶連接，16°C過夜，構建SUM0-BCSP31重組表達質粒； ⑥將獲得的SUM0-BCSP31重組表達質粒轉入大腸桿菌DH5a感受態細胞，篩選陽性克隆，獲得陽性克隆質粒； ⑦將陽性克隆質粒轉入大腸桿菌BL21進行誘導表達，終濃度為ImM的IPTG誘導6h后，超聲裂解菌體，離心收取上清和沉淀，所表達的BCSP31蛋白在細胞上清中； ⑧將上述細胞上清經鎳柱純化，再用BCA法測定純化的BCSP31蛋白的濃度，在53kDa處得到單一目的條帶。 ⑨將獲得的重組的布魯氏菌BCSP31蛋白凍干保存。
3.根據權利要求1所述的牛羊布魯氏菌病間接酶聯免疫吸附試驗抗體檢測試劑盒，其特征在于，所述洗滌緩沖液為PBST溶液，其配制方法為:稱取磷酸二氫鉀0.2g，磷酸氫二鈉2.9g，氯化鈉8.0g，氯化鉀0.2g，用雙蒸水溶解至1000mL,再加入ImL吐溫20，混勻，得到PBST溶液。
4.根據權利要求1所述的牛羊布魯氏菌病間接酶聯免疫吸附試驗抗體檢測試劑盒，其特征在于，所述封閉液的配制方法為:稱取磷酸二氫鉀0.2g，磷酸氫二鈉2.9g，氯化鈉 8.0g,氯化鉀0.2g，用雙蒸水溶解至1000mL,再加入ImL吐溫20，混勻，得到PBST溶液，量取PBST溶液100ml，加入2%BSA，搖勻，得到封閉液。
5.根據權利要求1所述的牛羊布魯氏菌病間接酶聯免疫吸附試驗抗體檢測試劑盒，其特征在于，所述終止液為2mol/L的硫酸溶液，其配制方法為:量取蒸餾水178.3ml，逐滴加入98%的濃硫酸21.7ml，得到終止液。
6.制備權利要求1所述的牛羊布魯氏菌病間接酶聯免疫吸附試驗抗體檢測試劑盒的方法，其特征在于，該方法的條件和步驟如下: (I)抗原包被酶標板 包被:以SUMO為表達載體在大腸桿菌BL21中誘導表達的重組布魯氏菌BCSP31蛋白為抗原，用抗原稀釋液稀釋純化的凍干抗原，得到濃度為119μ g/mL的抗原稀釋液，每孔加入.100 μ L稀釋抗原，包被酶標板，4°C過夜， 洗滌:棄掉抗原溶液，每孔加入300 μ L洗滌緩沖液洗滌，重復洗滌三次，每次3~.5min， 封閉:將酶標板置于濾紙上拍干至無水為止，每孔加入10(^1^封閉液，371:孵育I~.2h, 洗滌:棄掉封閉液，每孔加入300 μ L洗滌緩沖液洗滌，重復洗滌三次，每次3~5min ； (2)—抗孵育 用抗體稀釋液按待檢血清:抗體稀釋液=1: 80的比例稀釋待檢血清，將酶標板置于濾紙上拍干至無水為止，每孔加入100 μ L經過稀釋的待檢血清，37°C溫箱中孵育I~2h， 洗滌:棄掉待檢血清，每孔加入300 μ L洗滌緩沖液洗滌，重復洗滌三次，每次3~.5min ； (3)酶標二抗的孵育 用抗體稀釋液按照兔抗牛HRP-1gG:抗體稀釋液=1: 5000的比例稀釋兔抗牛HRP-1gG，用抗體稀釋液按照兔抗羊HRP-1gG:抗體稀釋液=1: 8000的比例稀釋兔抗羊HRP-1gG, 將酶標板置于濾紙上拍干至無水為止，每孔加入100 μ L經過稀釋的兔抗牛HRP-1gG或兔抗羊HRP-1gG，37°C溫箱中孵育I~2h， 洗滌:棄掉兔抗牛HRP-1gG或兔抗羊HRP-1gG，每孔加入300 μ L洗滌緩沖液洗滌，重復洗漆三次，每次3~5min ； (4)顯色 將酶標板置于濾紙上拍干至無水印為止，每孔加入50 μ L新鮮的TMB底物溶液，37°C溫箱中孵育10~15min ； (5)終止 每孔加入50 μ L終止液即2mol/L的硫酸溶液終止反應， 終止反應后，迅速采用酶聯免疫檢測儀測定酶標板的OD45tol值，當OD45tol值> 0.433時判為陽性，OD450nm值< 0.366時判為陰性。
7.根據權利要求6所述的牛羊布魯氏菌病間接酶聯免疫吸附試驗抗體檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，所述抗原稀釋液為pH=9.6,0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液，其配制方法為:稱取碳酸鈉1.59g，碳酸氫鈉2.93g，混合，用雙蒸水溶解至1000mL,于4°C儲存，備用，保存時間不超過I個月。
8.根據權利要求6所述的牛羊布魯氏菌病間接酶聯免疫吸附試驗抗體檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，所述抗體稀釋液為含有1%BSA的PBST溶液，其配制方法為:稱取磷酸二氫鉀0.2g，磷酸氫二鈉2.9g，氯化鈉8.0g和氯化鉀0.2g，用雙蒸水溶解至1000mL,量取ImL吐溫20，混勻，加入1%BSA，搖勻，得到抗體稀釋液。
9.根據權利要求6所述的牛羊布魯氏菌病間接酶聯免疫吸附試驗抗體檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，所述洗滌緩沖液為PBST溶液，其配制方法為:稱取磷酸二氫鉀.0.2g,磷酸氫二鈉2.9g,氯化鈉8.0g,氯化鉀0.2g,用雙蒸水溶解至1000mL,再加入ImL吐溫20，混勻，得到PBST溶液。
10.根據權利要求6所述的牛羊布魯氏菌病間接酶聯免疫吸附試驗抗體檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，所述封閉液為含有2%BSA的PBST溶液，其配制方法為:稱取磷酸二氫鉀0.2g，磷酸氫二鈉2.9g，氯化鈉8.0g,氯化鉀0.2g，用雙蒸水溶解至1000mL,再加入ImL吐溫20，混勻，得 到PBST溶液，量取PBST溶液100ml，加入2%BSA，搖勻，得到封閉液。
【文檔編號】G01N33/569GK103543261SQ201310418501
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年9月13日 優先權日:2013年9月13日
【發明者】楊艷玲, 郭利, 楊福合, 程世鵬, 李光玉, 陳立志, 李春義, 溫永俊 申請人:中國農業科學院特產研究所, 吉林特研生物技術有限責任公司