一種伊維菌素化學發光酶聯免疫快速檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種伊維菌素的檢測試劑盒，特別是一種伊維菌素化學發光酶聯免疫快速檢測試劑盒。包括盒體，設在盒體內的酶標板和設在盒體內試劑；所述酶標板的各孔包被有包被抗原，其中包被抗原由伊維菌素的代謝物與卵清蛋白偶聯制成；所述試劑包括：伊維菌素的單克隆抗體、酶標二抗即辣根過氧化酶標記的羊抗鼠的抗體、伊維菌素系列標準溶液、濃縮磷酸鹽緩沖液、濃縮洗滌液、發光液。使用上述試劑盒，采用加樣、洗滌、加酶標二抗、洗滌、加發光液、檢測、結果判定的步驟，所制備試劑盒具有高的靈敏度，其靈敏度可達0.01-5ng/ml，而且具有寬的線性動力學范圍，分析方法簡便快速結果穩定、誤差小，分析結果靈敏穩定可靠，安全性好及使用期長。
【專利說明】一種伊維菌素化學發光酶聯免疫快速檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種伊維菌素的檢測試劑盒，具體的說是一種伊維菌素化學發光酶聯免疫快速檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]20世紀90年代以后，絕大多數測定食品中伊維菌素類藥物殘留的理化檢測法主要依靠液相色譜技術進行分離，其次是色/質譜聯用技術，氣相色譜法、高效薄層色譜法等檢測法，因其各自特有的性能，在抗生素殘留檢測方面稍有應用。色譜法檢測牛乳中的藥物殘留要經過樣品處理(包括樣品的提取、脫蛋白、離心、層析柱凈化、衍生化等步驟)、殘留藥物的分離和殘留藥物的檢測。理化檢測法利用抗生素分子中的基團所具有的特殊反應或性質來測定其含量，能進行定性、定量分析和藥物鑒定，可作為乳中抗生素檢測的確證方法。該法檢測敏感性較高，但儀器及檢測費用高、檢測程序復雜、較耗時間等，這些不利因素使該法僅限于實驗室乳樣測定。
[0003]免疫學分析法是以抗原與抗體的特異性、可逆性結合反應為基礎的分析方法，目前藥物殘留免疫分析技術主要分三大類:相對獨立的分析方法、免疫分析技術與常規理化分析技術聯用的方法、免疫受體法。1973年荷蘭van weeman、sch μ rrs及瑞典Engvall、Perlmann分別提出酶聯免疫吸附法，30多年來國內外學者對免疫學方法檢測食品中抗生素進行了大量研究。但由于抗生素是半抗原，抗原構建技術難度大、免疫特異性強、檢測成本高，目前IDEXX實驗室公司、Cha瑚Sciences等公司在免分析法方面的研究較為成熟，國內該技術仍處于研究發展中。當前主要是用酶聯免疫吸附試驗、放射性免疫發光法、熒光免疫法、化學發光法等，對比現有的幾種標記免疫技術靈敏度的可知酶免與發光相比較，其酶免靈敏度較低。
【發明內容】
[0004]為了解決上述現有技術存在的缺陷，本發明提供了一種靈敏度高、檢測范圍寬、操作簡便快速、無毒無污染且所用儀器簡單經濟的檢測伊維菌素的化學發光酶聯免疫分析測定試劑盒，同時提供了其制備方法，以及檢測樣品中伊維菌素抗生素類的方法。
[0005]本發明為解決上述技術問題所采用的技術方案為:伊維菌素的化學發光酶聯免疫檢測試劑盒，包括盒體，設在盒體內的酶標板和設在盒體內試劑；所述酶標板的各孔包被有包被抗原，其中包被抗原由伊維菌素的代謝物與卵清蛋白偶聯制成；所述試劑包括:伊維菌素的單克隆抗體、酶標二抗即辣根過氧化酶標記的羊抗鼠的抗體、伊維菌素系列標準溶液、濃縮磷酸鹽緩沖液、濃縮洗滌液、發光液。
[0006]所述酶標板為不透明的聚苯乙烯8孔X 12條的96孔化學發光酶標板。
[0007]所述包被抗原濃度為5 μ g/ml。
[0008]所述伊維菌素單克隆抗體的工作濃度為1:15000。
[0009]所述伊維菌素的化學發光酶聯免疫檢測試劑盒:所述伊維菌素的單克隆抗體是由伊維菌素的代謝物與分子量范圍是6.7KDa飛.8 KDa的牛血清蛋白偶合制成的偶聯物作為免疫原免疫小鼠制備得到。
[0010]一種使用上述伊維菌素的化學發光酶聯免疫檢測試劑盒檢測殘余伊維菌素的方法，包括以下步驟:
1)加樣:向酶標板中加入50μ L/孔的伊維菌素系列標準濃度溶液或樣品溶液，然后加入伊維菌素抗體工作液50 μ L/孔，室溫(25°C )恒溫孵育2.5h ；
2)洗滌:傾出孔中液體，向酶標板中加入200μ L/孔的洗滌液，靜置5min后拍干，重復三次；
3)加酶標二抗:每孔加入酶標二抗工作液100μ L，室溫恒溫孵育1.5h ；
4)洗滌:傾出孔中液體，向酶標板中加入280μ L/孔的洗滌液，靜置5min后拍干，重復三次；
5)加發光液:每孔加入發光液100μ L ;
6)檢測:用化學發光免疫分析儀測定每孔的發光強度；
7)結果判定:以所測得的標準品發光值，除以第一個標準(O標準)的發光值再乘以100，得到抑制率(Β/Β0%)，以抑制率為縱坐標，伊維菌素濃度的對數為橫坐標作標準曲線，每一個樣品的濃度可以從標準曲線上讀出。
[0011]有益效果:本發明所制備的伊維菌素的化學發光酶聯免疫檢測試劑盒具有作為化學發光免疫分析最關鍵靈的優越的高靈敏度，其靈敏度可達0.01-5ng/ml，而且具有寬的線性動力學范圍，光信號持續時間長，其產生的光信號持續時間可達數小時甚至一天，分析方法簡便快速結果穩定、誤差小，樣品系直接自己發光，不需要任何光源照射，免除了各種可能因素(光源穩定性、光散射、光波選擇器等)給分析帶來的影響，使分析結果靈敏穩定可靠，安全性好及使用期長。
【具體實施方式】
[0012]一種伊維菌素的化學發光酶聯免疫檢測試劑盒，包括盒體，設在盒體內的酶標板和設在盒體內試劑；所述酶標板的各孔包被有包被抗原，其中包被抗原由伊維菌素的代謝物與卵清蛋白偶聯制成；所述試劑包括:伊維菌素的單克隆抗體、酶標二抗即辣根過氧化酶標記的羊抗鼠的抗體、伊維菌素系列標準溶液、濃縮磷酸鹽緩沖液、濃縮洗滌液、發光液。
[0013]所述酶標板為不透明的聚苯乙烯8孔X 12條的96孔化學發光酶標板。
[0014]所述包被抗原濃度為5 μ g/ml。
[0015]所述伊維菌素單克隆抗體的工作濃度為1:15000。
[0016]所述伊維菌素的化學發光酶聯免疫檢測試劑盒:所述伊維菌素的單克隆抗體是由伊維菌素的代謝物與分子量范圍是6.7KDa飛.8 KDa的牛血清蛋白偶合制成的偶聯物作為免疫原免疫小鼠制備得到。
[0017]利用上述伊維菌素的化學發光酶聯免疫檢測試劑盒檢測殘余伊維菌素的方法，包括以下步驟:
1)加樣:向酶標板中加入50μ L/孔的伊維菌素系列標準濃度溶液或樣品溶液，然后加入伊維菌素抗體工作液50 μ L/孔，室溫(25°C )恒溫孵育2.5h ；
2)洗滌:傾出孔中液體，向酶標板中加入200μ L/孔的洗滌液，靜置5min后拍干，重復三次；
3)加酶標二抗:每孔加入酶標二抗工作液100μ L，室溫恒溫孵育1.5h ；
4)洗滌:傾出孔中液體，向酶標板中加入280μ L/孔的洗滌液，靜置5min后拍干，重復三次；
5)加發光液:每孔加入發光液100μ L ;
6)檢測:用化學發光免疫分析儀測定每孔的發光強度；
7)結果判定:以所測得的標準品發光值，除以第一個標準(O標準)的發光值再乘以100，得到抑制率(Β/Β0%)，以抑制率為縱坐標，伊維菌素濃度的對數為橫坐標作標準曲線，每一個樣品的濃度可以從標準曲線上讀出。
[0018]1.制備所需試劑 制備濃縮洗滌液:
含有體積分數0.05%吐溫20mmol/L，pH 8.0的磷酸緩沖液。
[0019]制備校準液:
所述辣根過氧化酶標記的羊抗鼠的抗體的工作濃度優選1:15000。所述伊維菌素系列標準溶液濃度分別為:0.lng/mL、0.5ng/mL、0.8ng/mL、lng/mL、5ng/mL、10ng/mL。
[0020]所述包被抗原濃度優選5 μ g/mL，所述包被抗原制備具體由3_氨基_2_唑酮(AOZ)按照戊二醛法與活化的分子量范圍是6.7KDeT6.8KDa的卵清蛋(cOVA)偶聯完成。[0021 ] 本發明的化學發光酶聯免疫檢測試劑盒最低檢測限可達0.lng/ml，線性檢測范圍在0.l_20ng/ml，板內變異系數在10%以內，水樣品中回收率在78%_81%之間。
[0022]制備發光底物液
發光液是0.0lM魯米諾與pH=8.8 0.0OlM對甲苯酚的三(羥甲基)氨基甲垸溶液和體積比濃度為3/10000 H2O2的混合液。所述魯米諾為發光底物，對甲苯酚為發光增強劑。
[0023]1.2伊維菌素化學發光酶聯免疫檢測法的建立 ①抗體與包被抗原濃度的優選:
酶標板縱向用IOOmL/孔的，濃度梯度按80.0 μ g/ml>40.0 μ g/ml、20.0 μ g/ml、
9.0 μ g/ml、5.0 μ g/ml、2.5 μ g/ml、1.25 μ g/ml 和 0.625 μ g/ml 的包被抗原溶液包被，4°C放置過夜，用280 μ L/孔的洗漆液洗板三次,再用250 μ L/孔封閉液封閉，室溫放置2.5小時，洗滌三次；橫向加入100 μ L/孔，稀釋梯度按1:10(Tl:500的抗體溶液，室溫放置2小時,洗滌三次；加入100 μ L/孔的1: 15000的辣根過氧化酶標記的羊抗鼠抗體，室溫放置I小時，洗滌三次；加入IOOyL/孔的發光液，測定發光值。以發光值隨包被抗原的濃度有明顯梯度變化的包被抗原濃度和抗體稀釋度為最佳濃度進行特異性測定。
[0024]②抗體靈敏度的測定
經上述方陣法優選， 申請人:選擇包被抗原濃度為5 μ g/mL，抗體濃度為1:15000，進行抗體的靈敏度的測定:
(1)包被過程:用0.05M pH9.6的碳酸鹽緩沖液，將伊維菌素的包被抗原配成5 μ g/ml的溶液，每個聚苯乙烯板的反應孔中加100yL，4°C反應12h，棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗3次，200 μ L/孔，每次5分鐘，拍干；
(2)封閉過程:用250μ L/孔的封閉液封閉上述已包被的酶標板,室溫孵育2.5小時，洗漆;(3)競爭過程:加稀釋抗體(1:1000)100 μ L/孔與不同濃度的藥物50 μ L/孔于上述已封閉的反應孔中，室溫孵育2-4小時，洗滌；
(4)酶標過程:于各反應孔中加入新鮮稀釋辣根過氧化酶標記的羊抗鼠的抗體(1:15000) 100 μ L/孔，室溫孵育1.5小時，洗滌；
(5)發光過程:于各反應孔中加入100μ L/孔即時配制的發光液，立即用化學發光免疫分析儀檢測；
(6)計算過程:檢測結果以抑制率計算，抑制率=BX100/Β0，Β是加入競爭者的發光值，BO是沒有競爭者的發光值，計算50%抑制率時藥物的濃度即為該抗體的靈敏度。
[0025]2.3本發明的檢測伊維菌素的化學發光酶聯免疫試劑盒的組裝
(I)檢測伊維菌素的化學發光酶聯免疫試劑盒的組成
a、包被有包被抗原(Α0Ζ與卵清蛋白的偶聯物)的固相載體(不透明聚苯乙烯96孔化學發光酶標板);
b、伊維菌素抗體工作液(體積比濃度為1:1000)；
C、伊維菌素標準溶液6瓶,濃度分別為0.lng/mL、0.5ng/mL、0.8ng/mL、lng/mL、5ng/mL 和 lOng/mL ；
d、辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG抗體工作液(工作濃度為1:15000)；
e、濃縮磷酸鹽緩沖溶 液:80g的 NaCl, 2.0g 的 KH2PO4, 229.0g 的 Na2HPO4.12H20，2.0g的KCl溶于1000mL蒸餾水中；
f、濃縮洗滌液:上述濃縮磷酸鹽緩沖液加入體積比濃度為0.05mol/L的吐溫20(Tween20)；
g、發光液:0.01M魯米諾十0.0OlM對甲苯酚的三(羥甲基)氨基甲垸溶液(pH8.8)+體積比濃度為3/10000的H2O2。
[0026]2.4酶標板的制備
將包被抗原溶于包被液中，配成0.1ng/mL的溶液，酶標板的每孔加入10 μ L，4°C孵育12h，傾去包被液，每孔加入200 μ L洗滌液洗滌3次，拍干，然后加入250 μ L/孔的封閉液，37°C孵育2h，傾去孔內液體，洗滌液洗滌3次，拍干，用錫箔紙真空密封在4°C下保存。
[0027]2.5本發明的伊維菌素的酶聯免疫試劑盒的測定程序 試劑的準備
1)樣品稀釋液:將試劑盒中提供的濃縮磷酸鹽緩沖溶液用蒸餾水稀釋10倍后使用；
2)洗滌液:將試劑盒中提供的濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋10倍后使用；
3)發光液:0.01M魯米諾+0.0OlM對甲苯酚的三(羥甲基)氨基甲烷溶液(PH8.8)3/10000 (體積比)。
[0028]4.2樣品前處理
(1)水樣將水樣經過0.45 μ m的濾膜抽濾，然后加入體積比濃度為0.05%的吐溫-20。得到待測樣品；
(2)牛奶將牛奶樣品在4°C、10000轉/分鐘離心10分鐘，脫除脂肪層；將脫脂的牛奶按1:10洗滌液稀釋，得到待測樣品；
(3)尿樣將尿樣品在4°C，10000轉/分鐘離心10分鐘，去掉沉淀，將剩余的尿液用洗滌液按1: 10稀釋，得到待測樣品； (4)動物組織取樣品與4 mL0.1M的鹽酸混合，并且放在一起用超生波處理20 min，然后10000轉/分鐘離心20 min，取上清液用10 M NaOH調pH至8.0±0.5，旋渦振蕩5 min,然后10000轉/分鐘離心15 min ;取上清液加5 mL異丁醇振蕩2 min,混合物室溫下靜止15 min,然后3000轉/分鐘離心10 min,分出有機相,水相再用異丁醇(每次10 mL)萃取兩次，三次萃取的有機相合并在起，水浴減壓蒸干，殘余物用洗滌液重新溶解配成1: 10的溶液，得到待測樣品。
[0029]4.3檢測步驟
1)加樣:向酶標板中加入50μ L/孔的伊維菌素系列標準濃度溶液或樣品溶液，然后加入伊維菌素抗體工作液50 μ L/孔，室溫(25°C )恒溫孵育2.5h ；
2)洗滌:傾出孔中液體，向酶標板中加入280μ L/孔的洗滌液，靜置5min后拍干，重復三次；
3)加酶標二抗:每孔加入酶標二抗工作液100μ L，室溫恒溫孵育1.5h ；
4)洗滌:傾出孔中液體，向酶標板中加入200μ L/孔的洗滌液，靜置5min后拍干，重復三次；
5)加發光液:每孔加入發光液100μ L ;
6)檢測:用化學發光免疫分析儀測定每孔的發光強度。
[0030]4.4結果判斷
以所測得的標準品發光值，除以第一個標準(O標準)的發光值再乘以100，得到抑制率(Β/Β0%)，以抑制率為縱坐標，伊維菌素濃度的對數為橫坐標作標準曲線，每一個樣品的濃度可以從標準曲線上讀出。
[0031]抑制率=標準品發光值(或樣品)X 100/0標準品發光值。
【權利要求】
1.一種伊維菌素的化學發光酶聯免疫檢測試劑盒，包括盒體，設在盒體內的酶標板和設在盒體內試劑；所述酶標板的各孔包被有包被抗原，其中包被抗原由伊維菌素的代謝物與卵清蛋白偶聯制成；所述試劑包括:伊維菌素的單克隆抗體、酶標二抗即辣根過氧化酶標記的羊抗鼠的抗體、伊維菌素系列標準溶液、濃縮磷酸鹽緩沖液、濃縮洗滌液、發光液。
2.如權利要求1所述的伊維菌素的化學發光酶聯免疫檢測試劑盒，其特征在于:所述酶標板為不透明的聚苯乙烯8孔X 12條的96孔化學發光酶標板。
3.如權利要求1所述的伊維菌素的化學發光酶聯免疫檢測試劑盒，其特征在于:所述包被抗原濃度為5 μ g/ml。
4.如權利要求1所述的伊維菌素的化學發光酶聯免疫檢測試劑盒，其特征在于:所述伊維菌素單克隆抗體的工作濃度為1:15000。
5.如權利要求1所述的伊維菌素的化學發光酶聯免疫檢測試劑盒，其特征在于:所述伊維菌素的單克隆抗體是由伊維菌素的代謝物與分子量范圍是6.7KDeT6.8 KDa的牛血清蛋白偶合制成的偶聯物作為免疫原免疫小鼠制備得到。
6.一種利用權利要求1所述的伊維菌素的化學發光酶聯免疫檢測試劑盒檢測殘余伊維菌素的方法,,使用伊維菌素系列標準溶液濃度分別為:0.1ng/mL (O標準)、0.5ng/mL、.0.8ng/mL、lng/mL、5ng/mL、10ng/mL,其特征在于,包括以下步驟: . 1)加樣:向酶標板中加入50μ L/孔的伊維菌素系列標準濃度溶液或樣品溶液，然后加入伊維菌素抗體工作液50 μ L/孔，室溫(25°C )恒溫孵育2.5h ； . 2)洗滌:傾出孔中液體，向酶標板中加入200μ L/孔的洗滌液，靜置5min后拍干，重復三次； .3)加酶標二抗:每孔加入酶標二抗工作液100μ L，室溫恒溫孵育1.5h; 4)洗滌:傾出孔中液體，向酶標板中加入280μ L/孔的洗滌液，靜置5min后拍干，重復三次； . 5)加發光液:每孔加入發光液100μ L ; . 6)檢測:用化學發光免疫分析儀測定每孔的發光強度； . 7)結果判定:以所測得的伊維菌素系列標準濃度溶液對應的孔的發光值，除以第一個標準(O標準)的發光值再乘以100，得到抑制率Β/Β0%，以抑制率為縱坐標，各伊維菌素系列標準濃度溶液濃度的對數為橫坐標作標準曲線，根據樣品溶液所對應的孔的發光值和所得標準曲線，計算得到樣品溶液的濃度。
【文檔編號】G01N21/76GK103675287SQ201310673734
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月12日 優先權日:2013年12月12日
【發明者】王善普, 鄭鳴, 郭宏偉, 靳婉霞, 吳庭才 申請人:洛陽萊普生信息科技有限公司