酞酸酯類塑化劑通用半抗原、抗原的合成方法及應用的制作方法
【專利摘要】本發明“酞酸酯類塑化劑通用半抗原、抗原的合成方法及應用”，涉及生物檢測技術。本發明以4-硝基鄰苯二甲酸為原料，通過酯化和還原反應，形成半抗原，用戊二醛法將其與載體蛋白偶聯，得到酞酸酯類塑化劑通用人工抗原。通過紫外光譜掃描證實了人工抗原的成功合成，免疫動物實驗表明本發明制備的人工抗原具有良好的免疫原性，產生的抗體群選性好，靈敏度高。本發明的抗原或抗體可用于酞酸酯類塑化劑的免疫分析中，滿足快速檢測食品或環境介質中的酞酸酯類塑化劑殘留的需要，應用前景廣闊。
【專利說明】酞酸酯類塑化劑通用半抗原、抗原的合成方法及應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物檢測技術，具體為酞酸酯類塑化劑通用人工抗原的制備方法及應用。
【背景技術】
[0002]酞酸酯(Phthalic Acid Esters，PAEs)類化合物是塑料生產中最常用的一類塑化劑，占增塑劑市場份額的88%，大約包含30種化合物，最常用的如鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)等，主要用于生產醫療制品、塑料玩具、化妝品、食品包裝、農用地膜等，由于酞酸酯與產品基質間為非共價結合，致使其在生產、加工和使用過程中不斷向環境中釋放，已成為全球性的最普遍的一類環境污染物。毒理學研究表明:酞酸酯是一類內分泌干擾物，具有雌激素效應，并表現出一定的生物累積性，是一種具有生殖毒性和發育毒性的環境雌激素，并與肥胖癥和糖尿病的發生有關。美國EPA和我國環境監測總部都將酞酸酯類化合物列為環境中優先控制的有機污染物，衛生部也將16種酞酸酯列入《食品中可能違法添加的非食用物質和易濫用的食品添加劑名單(第六批)》。
[0003]目前酞酸酯的檢測多采用儀器分析法，需要昂貴的儀器設備和專業技術人員，對檢材要求較高，樣品前處理和提純過程費時費力，不能滿足現代檢測對方便、快速、準確的要求。酶聯免疫吸附法和膠體金試紙條法操作簡便，對樣本要求不高，可實現現場快速檢測的要求。但是，酞酸酯類化合物種類繁多，常常為多個化合物同時被檢出。現有的免疫分析主要針對特定的酞酸酯化合物，不能實現酞酸酯類塑化劑的多殘留檢測。因此，本發明以4-硝基鄰苯二甲酸為原料，設計一種酞酸酯類塑化劑的通用人工抗原，為建立酞酸酯類塑化劑的多殘留免疫檢測技術提供基礎。
【發明內容】
[0004]本發明針對目前酞酸酯類塑化劑免疫分析檢測領域的需求和不足，提供一種酞酸酯類塑化劑通用半抗原和人工抗原的合成方法。試驗數據表明，該通用抗原具有較高的免疫原性，制備的抗血清與酞酸酯類塑化劑具有良好的親和性，抗體通用性好，靈敏度高。
[0005]一種酞酸酯類塑化劑的通用半抗原，其特征在于:其分子結構式如式(I)所示:
【權利要求】
1.一種酞酸酯類塑化劑的通用半抗原，其分子結構式如式(I)所示:
2.一種酞酸酯類塑化劑的通用人工抗原，其特征在于:是在權利要求1中所述的通用半抗原式(I)的氨基基團上偶聯載體蛋白得到的分子。
3.權利要求2所述的載體蛋白為牛血清白蛋白BSA、雞卵清白蛋白OVA、人血清白蛋HSA、鑰孔血藍蛋白KLH中的一種。
4.權利要求1所述的通用半抗原的合成方法，其合成步驟為: (1)取10-20g的4-硝基鄰苯二甲酸，加入到30mL無水乙醇，邊攪拌邊緩慢加入H2SO4,120°C反應7h，蒸餾除去反應產生的水和多余的乙醇；趁熱轉至冰水中，取析出固體用10%的Na2CO3 (pH7-8)洗滌至水層無色后，用無水乙醇重結晶得到淺黃色晶體； (2)取0.7-1.5g的淺黃色晶體溶于200mL苯中，加入純鋅粉，分次加入濃HCL，室溫下攪拌12h后向反應液中加入冷水,用NaOH中和反應液至堿性,用苯進行分離萃取,萃取液經水洗后用無水Na2SO4干燥 ，蒸餾除去苯后用無水乙醇重結晶，得到淡黃色晶體，即為酞酸酯類塑化劑通用半抗原。
5.權利要求2所述的通用人工抗原的合成方法，其合成步驟為: (1)取酞酸酯類塑化劑通用半抗原加入N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，在室溫磁力攪拌下至充分溶解后，4°C下逐滴加入2.5%的戊二醛溶液，半抗原:戊二醛=1:2 (摩爾比)，避光混勻并在磁力攪拌下反應2h，得到A液； (2)取牛血清白蛋白，半抗原:牛血清白蛋白=80:1(摩爾比)，用pH9.6,0.05M的碳酸鹽緩沖液溶解，低溫保存，此液為B液； (3)在冰水浴中將A液緩慢滴加到B液中，并在攪拌條件下繼續反應過夜，將混合液移入透析袋中，用PBS緩沖液透析3-4天，每天更換2次PBS緩沖液；使用凍干法將透析袋中的液體制成粉末，即得到酞酸酯類塑化劑通用人工抗原。
6.權利要求2和3所述的通用人工抗原的應用，其特征在于在制備抗血清、抗體或雜交瘤細胞中的應用。
7.權利要去2和3所述的通用人工抗原的應用，其特征在于在檢測酞酸酯類塑化劑、食品或環境介質中的酞酸酯類塑化劑殘留中的應用。
【文檔編號】G01N33/544GK104130144SQ201410368522
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年7月30日 優先權日:2014年7月30日
【發明者】孫鳳霞, 羅小玲, 彭夏雨, 盧春霞, 康立超, 唐宗貴, 方婷婷, 謝勇 申請人:新疆農墾科學院, 孫鳳霞