一種快速評價殺菌劑對生物膜剝離能力的方法
【專利摘要】一種快速評價殺菌劑對生物膜剝離能力的方法，屬于石油【技術領域】，配備待測試的殺菌劑，制備具有生物膜的多個試片，準備多組電化學阻抗測試用三極電池，每組以具有生物膜的試片為工作電極，以飽和甘汞電極為參比電極，金屬鉑電極為輔助電極；在各殺菌劑溶液中分別放置一組上述三極電池，分別取得與各殺菌劑溶液對應的電化學阻抗值；從各組電化學阻抗值中分別獲得各殺菌劑溶液的阻抗值或容抗值，以此評價殺菌劑溶液的濃度對生物膜的剝離能力。本發明模擬現場，輔助生物膜內細菌含量測定，從而獲得不同殺菌劑、同一殺菌劑在不同濃度下的剝離效果，為確定現場殺菌劑投加劑量和投加周期、提高現場殺菌劑應用效果提供依據。
【專利說明】一種快速評價殺菌劑對生物膜剝離能力的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于石油工程應用【技術領域】，特別是評價殺菌劑對生物膜的剝離能力的技術方法。
【背景技術】
[0002]許多研究表明，在油氣田水系統中生物膜(B1film)下腐蝕是MIC的主要表現形式，且生物膜下碳鋼腐蝕被認為是不均勻的。生物膜(B1film)是在相對封閉水環境體系中形成的一層微生物膜。該膜主要由微生物體同水體中的鹽及無機離子形成的一層有機質膜。在生物膜中，微生物生活在一個與自由懸浮狀態完全不同的微生態環境中，微生物大體上是不動的，被包藏與水化的有機質中。生物膜中的細胞密度比懸浮狀態要高，有時甚至高出5?6個數量級，相鄰位置細胞之間通過長時間接觸可能產生生理相互作用，導致協同微生物作用。生物膜中可存在多種菌屬，包括硫酸鹽還原菌(SRB)、硝化菌、脫氮細菌和各種異養微生物，細菌密度在17?101°菌落單位/cm2生物膜范圍內波動。當金屬表面存在微生物膜時，金屬表面和微生物膜間界面的PH值、有機物和無機物的種類和濃度、礦化物等都大大有別于本體溶液，生物膜內的反應改變了腐蝕的機理和速率。
[0003]生物膜腐蝕的危害不僅在于其對設備的腐蝕，更重要的是引起腐蝕的突發性，給工業生產帶來嚴重的影響，但生物膜的存在，使殺菌效率降低、甚至失效，以至于產生耐藥菌。故考察殺菌劑對生物膜內的微生物的殺滅作用是控制生物膜腐蝕的重要研究方向。
[0004]硫酸鹽還原菌、腐生菌和鐵細菌是油田水系統腐蝕性較強的主要菌群，浮游的微生物通常采用化學殺菌的手段加以控制，且對液體介質中的細菌數量檢測手段比較成熟。而對于生物膜下細菌的殺菌濃度及生物膜的剝離能力則鮮有測試及評價的方法。這是因為生物膜是一種不均勻的動態膜，其膜內環境的復雜性使我們很難對生物膜的性質和狀態進行定量描述。
[0005]從二十世紀八十年代起，電化學阻抗法被廣泛的應用到腐蝕相關的研究中，具有對測試本體無破壞、準確直觀、測試簡單等特點。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供一種快速、準確的用于評價殺菌劑對生物膜的滲透和剝離能力的快速評價方法。
[0007]本發明包括以下步驟:
O配備待測試的殺菌劑:以水將殺菌劑配制成至少兩種不同濃度的殺菌劑溶液；
2)制備具有生物膜的多個試片:將與油田采出水集輸管線材料相同的多個試片分別浸入含腐蝕性微生物的介質中，待試片表面附著有生物膜后取出各試片；
3)準備多組電化學阻抗測試用三極電池:每組以具有生物膜的試片為工作電極，以飽和甘汞電極為參比電極，金屬鉬電極為輔助電極；
4)電化學阻抗測試:在各殺菌劑溶液中分別放置一組上述三極電池，分別取得與各殺菌劑溶液對應的電化學阻抗值；
5)從各組電化學阻抗值中分別獲得各殺菌劑溶液的阻抗值或容抗值，以此評價殺菌劑溶液的濃度對生物膜的剝離能力。
[0008]本發明通過電化學阻抗法，模擬現場，輔助生物膜內細菌含量測定，從而獲得不同殺菌劑、同一殺菌劑在不同濃度下的剝離效果，為確定現場殺菌劑投加劑量和投加周期、提高現場殺菌劑應用效果提供了有力的依據。
[0009]本發明電化學阻抗法是一種對生物膜的完整程度及狀態變化響應非常靈敏的電化學方法，當殺菌劑在介質中擴散到達生物膜表面后，其對生物膜的破壞和剝離會產生相應的響應，如電阻增大，電容減小，此外，在bode圖上還可以反映出相位角常數的增減，峰值對應的頻率的改變等等直觀信息。
[0010]本發明具有以下優點:
1、使用電化學阻抗法對生物膜表面影響甚微。
[0011]2、電化學阻抗法間接評價殺菌劑對生物膜的剝離能力，并可獲得殺菌劑的最佳添加劑量、作用周期；同時輔助生物膜下細菌測定，進一步驗證殺菌劑對生物膜剝離和膜下細菌的殺滅效果。和采用游離介質中細菌抑制的常用殺菌劑評價方法一絕跡稀釋法相比，對現場藥劑的投加更具有指導意義。
[0012]為了快速地獲得試驗用試片，本發明在所述步驟2)中，將密封有試片的介質置于30?60°C恒溫環境下培養14天。
[0013]為了方便試驗，所述試片的工作面積優選為0.5?1.5cm2。
[0014]另外，本發明在進行電化學阻抗測試時，以開路電位作為工作電位，振幅為5mV，測試頻率范圍為0.005?100000Hz。開路電位是值工作電極與參比電極之間的電勢差，也成為自然腐蝕電位。自然腐蝕電位是腐蝕金屬電極的一個重要熱力學參數，在本發明中，可反映帶生物膜試片表面的穩定電位，進行交流阻抗時，選擇開路電位為穩定電位，圍繞這個電位進行小幅擾動，可最大限度反映殺菌劑對生物膜不同剝離能力的真實情況。
[0015]交流阻抗測試外加的擾動信號要求很小，目的是滿足線性關系，本發明是基于保證生物膜物理完整性的前提下通過阻抗獲得的電阻電容等信息來獲得不同剝離能力殺菌劑對生物膜的剝離和破壞作用。具生物膜的碳鋼表面電位的差異通常在幾十個毫伏以內，因此選擇此幅值的振幅可確保實驗結果的有序和真實性。
[0016]化學反應速度不同的過程很容易在頻率域上分開，速度快的子過程出現在高頻區，速度慢的子過程出現在低頻區，因此電化學阻抗譜的高頻區域(>10E4Hz)主要反映的是材料表面的雙電層結構特性，屬于電化學控制，低頻區域(〈10E-2)則反映膜的致密程度及金屬離子的擴散情況，屬于擴散控制，在本發明中用來反映生物膜的完整性及致密性，進而反映殺菌劑的剝離能力。在較寬頻率范圍內測量得到的阻抗譜，能比其它常規的電化學方法得到更多的電極過程動力學信息和電極界面結構信息。故選擇測試頻率為0.005?100000Hz。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0017]圖1為加入不同濃度的殺菌劑KD-24的阻抗Nyquest圖。
[0018]圖2為加入不同濃度的殺菌劑KD-24后體系等效電路圖。
[0019]圖3為加入不同濃度的KD-24后電阻值與濃度的變化關系圖。
[0020]圖4為加入不同濃度的KD-24后電容值與濃度的變化關系圖。
[0021]圖5為經過電化學阻抗試驗后的試片進行細菌培養的結果對比表。
【具體實施方式】
[0022]一、試片準備:
以下金屬試片材料與油田采出水集輸管線材料相同，都為金屬材料。事先分別加工成大小相同、厚度相同、具有相同表面積(如，工作面積為0.5?1.5cm2)的多個金屬試片，并測得、記錄各金屬試片的表積面。
[0023]1、先將各金屬試片用金相砂紙打磨至鏡面，再以丙酮去油、以無水乙醇脫脂，經干燥后置于干燥器中，并放于紫外線下消毒，備用。
[0024]2、將采樣的油氣田水系統的污水罐裝于容器中，并向容器內接種SRB培養，然后將從干燥器中取出的各試片分別懸于污水中，并采用橡膠塞密封，以隔絕空氣。將該厭氧體系置于37°C恒溫箱中培養14天，即獲得覆蓋大量生物膜的多個具有生物膜的試片。
[0025]二、殺菌劑的準備:
本發明方法可以對不同的殺菌劑進行測試評價。本例對殺菌劑KD-24進行測試評價:在八個測試池中，分別以SRB培養基為介質配制成殺菌劑含量分別為10mg/L、20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L、60 mg/L、70 mg/L的殺菌劑溶液,另在一個測試池中作空白對照組。
[0026]三、電化學阻抗試驗:
準備八組三極電池組，各組中以將帶生物膜的試片作為工作電極，以飽和甘汞電極為參比電極，以金屬鉬電極為輔助電極。
[0027]在具有不同含量的殺菌劑的八組測試池中，分別將放入一組三極電池組，并分別連接電化學測試儀器，如科斯特CS電化學工作站。
[0028]在進行電化學阻抗測試時使用開路電位作為工作電位，振幅為5mV，測試頻率范圍為0.005?100000Hz。待測試池中電化學開路電位穩定后分別開始測量。
[0029]通過以上方法分別獲得如圖1所示的阻抗Nyquest圖。
[0030]若需評價殺菌劑的長效性,可添加同一殺菌劑后在不同的時刻點如lh,4h,8h,16h,24h,48h等等分別進行記錄。
[0031]四、分析:
將測得的電化學數據——如圖1所示的阻抗Nyquest采用zView2軟件進行擬合和分析，獲得擬合等效電路圖譜，見圖2，并分別獲得與八個測試池體系相對應的八組阻抗值和容抗值。
[0032]將不同體系的電容及阻抗值對殺菌劑的濃度做圖，分別得到圖3所示的加入不同濃度的KD-24后電阻值與濃度的變化關系圖和圖4所示的加入不同濃度的KD-24后電容值與濃度的變化關系圖。
[0033]從圖3和圖4中可見:KD_24的濃度從O至60 mg/L之間，隨著濃度的增加，體系內電阻值和電容值也相應增加，但KD-24的濃度為60 mg/L至70 mg/L之間體系內電阻值和電容值趨于穩定，說明:采用濃度為70mg/L的殺菌劑KD-24溶液對生物膜的剝離作用是較合適的。
[0034]五、驗證:
將測試后的各試片用滅菌生理鹽水沖洗去除殘留殺菌劑，置于已滅菌的試驗瓶中，注滿培養基，在37°C下恒溫培養I周，觀察試驗瓶中培養液是否變黑評價所加殺菌劑在不同濃度下對生物膜中SRB的是否完全殺滅，驗證殺菌劑對生物膜下細菌的殺滅效果。制成如圖5所示的表。
[0035]從圖5的表可見:在濃度為70mg/L的殺菌劑KD-24溶液中處理后的試片上無活性生物存留。這也進一步驗證了采用濃度為70mg/L的殺菌劑KD-24溶液對生物膜的剝離的較果是最佳的。
[0036]解析:由于體系采用SRB的培養基，電導率較大，因此高頻區阻抗環為不完整的四分之一圓環。隨著殺菌劑加入量的增加，電極表面電阻不斷增大，電容不斷減小。說明KD-24與生物膜接觸后，通過與生物膜中細菌的吸附作用，在抑制細菌呼吸殺死細菌的同時，也不斷滲透進入疏松的生物膜中，生物膜被剝離后金屬表面腐蝕產物及生物膜層變薄，因而電容值不斷變小，抗菌劑覆蓋率增加，季銨鹽對基體材料既有緩蝕作用，因此阻抗值隨著殺菌劑濃度的增大而增大，在加入量為70mg/L時電阻和電容都趨于穩定值，生物膜完全剝離；同時，殺菌劑KD-24在加入量為70mg/L時，培養瓶培養一周后培養液依然透明，說明生物膜下細菌完全殺滅。
[0037]六、應用:
采用濃度為70mg/L的殺菌劑KD-24溶液對現場的油氣田水系統進行生物膜剝離。
[0038]效果優于以往技術。
【權利要求】
1.一種快速評價殺菌劑對生物膜剝離能力的方法，其特征在于包括以下步驟: 1)配備待測試的殺菌劑:以水將殺菌劑配制成至少兩種不同濃度的殺菌劑溶液； 2)制備具有生物膜的多個試片:將與油田采出水集輸管線材料相同的多個試片分別浸入含腐蝕性微生物的介質中，待試片表面附著有生物膜后取出各試片； 3)準備多組電化學阻抗測試用三極電池:每組以具有生物膜的試片為工作電極，以飽和甘汞電極為參比電極，金屬鉬電極為輔助電極； 4)電化學阻抗測試:在各殺菌劑溶液中分別放置一組上述三極電池，分別取得與各殺菌劑溶液對應的電化學阻抗值； 5)從各組電化學阻抗值中分別獲得各殺菌劑溶液的阻抗值或容抗值，以此評價殺菌劑溶液的濃度對生物膜的剝離能力。
2.根據權利要求1所述方法，其特征在于所述步驟2)中，將密封有試片的介質置于30?60°C恒溫環境下培養14天。
3.根據權利要求1或2所述方法，其特征在于所述試片的工作面積為0.5?1.5cm2。
4.根據權利要求1所述方法，其特征在于在進行電化學阻抗測試時，以開路電位作為工作電位，振幅為5mV，測試頻率范圍為0.005?100000Hz。
【文檔編號】G01N27/06GK104198543SQ201410453359
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月9日 優先權日:2014年9月9日
【發明者】王彪, 姚峰, 楊帆, 吳偉林, 劉宏芳, 秦雙 申請人:中國石油化工股份有限公司, 中國石油化工股份有限公司江蘇油田分公司