一種快速檢測氨基甲酸乙酯含量的分光光度方法
【專利摘要】一種快速檢測氨基甲酸乙酯含量的分光光度方法，屬于分析化學、食品安全檢測【技術領域】。本發明將氨基甲酸乙酯降解酶和谷氨酸脫氫酶構建了雙酶偶聯體系；氨基甲酸乙酯降解酶將氨基甲酸乙酯水解生成乙醇、水和氨，在谷氨酸脫氫酶催化下氨與共底物α-酮戊二酸反應生成谷氨酸，同時伴隨著還原型輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)被氧化。從而該體系將氨基甲酸乙酯含量轉化成NADH含量的變化，利用NADH在340nm處吸光值的變化，實現對液態體系中氨基甲酸乙酯含量的檢測。該方法能夠快速檢測溶液及模擬黃酒體系中的氨基甲酸乙酯，檢測限低至0.1μmol·L-1，為發酵食品和飲料中氨基甲酸乙酯的檢測提供了有效的手段。
【專利說明】一種快速檢測氨基甲酸乙酯含量的分光光度方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種快速檢測氨基甲酸乙酯含量的分光光度方法，屬于分析化學、食 品安全檢測【技術領域】。
【背景技術】
[0002] 氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate，簡稱EC)，是一種具有遺傳毒性及致癌性的物 質，對嚙齒類動物，可導致肺癌、淋巴癌、肝癌和皮膚癌等疾病。EC廣泛存在于發酵食品(如 醬油、腐乳等)、釀造酒(如黃酒、清酒、葡萄酒、蘋果酒等)和蒸餾酒(如白蘭地、威士忌等)中， 主要通過酒精類飲料的攝入進入人體內。研究表明氨基甲酸乙酯在生物體內約有0. 5%被 細胞色素 P450氧化為乙酰基氨基甲酸乙酯，再進一步形成乙酰基氨基甲酸乙酯環氧化物， 此種物質能夠在生物體內形成DNA加聚物，導致DNA結構的雙鏈被破壞，進而導致細胞癌 變；另有〇. 1%左右的氨基甲酸乙酯被細胞色素 P450氧化為N-羥基氨基甲酸乙酯，這種物 質誘導Cu2+調控的DNA損傷，引起癌變。
[0003] 早在1985年，加拿大衛生與預防部門對酒精類飲料中的氨基甲酸乙酯含量做了 強制性限量標準，隨后世界其他國家也先后制定了各種飲料酒中的限量標準。同時，采取減 少和去除食品中EC前體物質、選用選擇性強和特性良好的能降低發酵過程中尿素排泄量 的菌株、對發酵過程和蒸餾過程進行工藝改良、對發酵酒進行脲酶和EC降解酶酶法后處理 等方法降低成品中EC的含量。各種檢測飲料酒以及其他發酵食品中氨基甲酸乙酯含量的 方法也不斷發明和改善。
[0004] 現階段檢測氨基甲酸乙酯含量的方法主要有：薄層分析法、傅立葉變換近紅外 光譜法（FTIR)，近紅外光譜技術（NIR)，氣相色譜分析法（GC)，氣相色譜-質譜聯用法 (GC-MS)，氣相色譜-串聯質譜法（GC/MS/MS)，氣相二維或多維色譜-穩定同位素稀釋質譜 聯用技術（GC/GC/CIMS)，氣相色譜/熱離子檢測器法（GC/TSD)，高效液相色譜（HPLC)以及 高效液相-熒光法（HPLC-FLD)，液相色譜-串聯質譜法（HPLC/MS/MS)等。以上檢測方法 雖然能夠在一定范圍內對氨基甲酸乙酯含量進行檢測和定量，但大多需要對樣品進行預處 理、操作繁瑣費時、重現性差、操作系統誤差較大、方法的準確度和精確度較差、特異性低、 容易受到發酵基體中其他物質的干擾，特別是氣相色譜以及各種萃取方法需要有毒有機溶 劑不利于分析人員的身體健康，在萃取過程及溶劑回收過程中會伴隨著嚴重的污染問題； 往往需要精密昂貴的檢測儀器如質譜、電子捕獲檢測器、原子發射光譜檢測器等，并且維護 成本高，只能在具有大型、貴重儀器的專業實驗室內進行檢測，難以推廣使用，不能滿足我 國發酵食品及酒精飲料中氨基甲酸乙酯快捷、簡便、經濟、環保的檢測要求和限制標準。因 此，研發和建立方便實用的快速檢測方法是對發酵食品和飲料中EC含量檢測所迫切需要 解決的問題。
[0005] 隨著生物傳感器的發展，雙酶和多酶聯用的生物傳感器逐漸引起人們關注并得到 了廣泛的應用。現階段已有許多酶傳感器用于水體中氨、尿素、重金屬離子、過氧化氫、苯 酚、有機磷殺蟲劑、壞血酸、谷氨酸以及其他氨基酸的檢測。但目前還沒有報道用于檢測EC 含量的酶傳感器。
[0006] 在2012年，本課題組的專利ZL201210125030. 6《一種黃酒用氨基甲酸乙酯降解 酶產生菌》，已公開了一種黃酒用氨基甲酸乙酯EC降解酶產生菌，其分類命名為變幻青霉 rariaAi/e) JN-A525,已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物 中心，其保藏編號為：CGMCC No. 5763。
[0007] 本發明在前期篩選出產氨基甲酸乙酯降解酶的菌株的基礎上，構建了氨基甲酸乙 酯降解酶和谷氨酸脫氫酶雙酶體系實現對EC的快速檢測。
【發明內容】
[0008] 本發明的目的是提供一種用于快速檢測溶液中氨基甲酸乙酯含量的分光光度方 法，要解決的技術問題是構建檢測氨基甲酸乙酯所需要的雙酶偶聯體系。該體系中氨基甲 酸乙酯降解酶將氨基甲酸乙酯水解生成乙醇、水和氨，在谷氨酸脫氫酶催化下氨與共底物 α -酮戊二酸反應生成谷氨酸，同時伴隨著還原型輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH被氧 化。從而該體系將氨基甲酸乙酯含量轉化成NADH含量的變化，利用NADH在340 nm處吸光 值的變化，實現對液態體系中氨基甲酸乙酯含量的檢測，原理圖如圖1所示。
[0009] 本發明的技術方案，一種快速檢測氨基甲酸乙酯含量的分光光度方法，步驟為： (1) 構建雙酶偶聯催化體系 a、 酶源：氨基甲酸乙酯降解酶，對氨基甲酸乙酯EC降解酶產生菌菌株CGMCC N0. 5763 細胞培養后經超聲破碎、離心、濃縮、凝膠層析、超濾濃縮后所得；谷氨酸脫氫酶則為市售商 品酶； b、 酶液以及其他溶液的制備：用
【權利要求】
1. 一種快速檢測氨基甲酸乙酯含量的分光光度方法，其特征在于步驟為： (1) 構建雙酶偶聯催化體系 a、 酶源：氨基甲酸乙酯降解酶，對氨基甲酸乙酯EC降解酶產生菌菌株CGMCC No. 5763 細胞培養后經超聲破碎、離心、濃縮、凝膠層析、超濾濃縮后所得；谷氨酸脫氫酶則為市售商 品酶； b、 酶液以及其他溶液的制備：用25mmol噸4 PBS緩沖液溶解氨基甲酸乙酯降解酶以及 谷氨酸脫氫酶，使得二者酶活分別為16U · ml/1及10U · ml/1 ;配制540mmol · Γ1 α -酮戊二 酸溶液；7. 5mmol · PNADH以及不同濃度的氨基甲酸乙酯標準溶液； c、 雙酶偶聯體系的構建：向反應體系中分別加入20 μ L上述氨基甲酸乙酯降解酶和谷 氨酸脫氫酶溶解液，66 μ L的α -酮戊二酸溶液，20 μ L NADH溶液，20 μ L lmmol · L-1氨基 甲酸乙酯溶液和454 μ L PBS緩沖液，使得總反應體系體積為600 μ L,置于石英比色皿中混 合均勻；然后將此反應體系置于分光光度計中用動力學方法監測溶液中NADH在340nm處吸 光值的變化情況； (2) 雙酶偶聯體系對氨基甲酸乙酯含量的快速測定： d、 用純度大于99%的氨基甲酸乙酯配制濃度為0. 001、0. 005、0. 01、0. 05、0. 1、0. 5和 1 mmol · L 1的母液； e、 向雙酶偶聯體系中加入適當體積和濃度的氨基甲酸乙酯母液使得反應體系中氨基 甲酸乙酯濃度分別為0、0· 1、0· 2、0· 5、1、2、5、10、20、30、40、50 μπιο?噸―1 ;將所得的溶液體 系混合均勻后置于分光光度計中用動力學方法監測NADH在340 nm處吸光值的變化，反應 時間為5min ;將EC的濃度與340nm處吸光值在5min內的變化制作得到標準曲線； f、 向黃酒樣品中添加氨基甲酸乙酯母液使得樣品中EC含量為5、10、20μπι〇1 · Γ1，在 雙酶偶聯反應體系中反應5min后檢測NADH在340nm處的吸光值變化，通過對比標準曲線 計算模擬酒樣中氨基甲酸乙酯含量。
【文檔編號】G01N21/31GK104266984SQ201410533042
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年10月11日 優先權日:2014年10月11日
【發明者】周楠迪, 盧曉霞, 田亞平 申請人:江南大學