一種過氧化氫酶的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物制藥領域，涉及藥用過氧化氫酶的生化分離技術。具體地說是采用鹽析、多重結晶結合透析等技術來提取過氧化氫酶。
【背景技術】
[0002]過氧化氫酶是從牛肝臟或豬肝臟中分離純化得到的一種蛋白酶。它主要的功用有:能使膿、痰液、血凝塊等分解、變稀，易于引流排除，加速創面凈化，促進肉芽組織新生，此外還有抗炎癥作用。臨床上用于膿胸、血胸、外科炎癥、潰瘍、創傷性損傷、瘺管等所產生的局部水腫、血腫及膿腫等。噴霧吸入，用于呼吸道疾病。也可用于治療毒蛇咬傷。還常用于動物細胞培養前對組織的處理。
[0003]用傳統的方法僅提取過氧化氫酶是相當困難的。2006年7月上海阿敏制藥有限公司公開了一種過氧化氫酶的制備方(200610023582.0)，其采用低溫酸提、梯度鹽析、冰水透析、親和層析、乙醇醇析的產品工藝，得到過氧化氫酶。2011年1月馬忠仁等申請了一種提取過氧化氫酶的方法(200910170682.X)，其采用了 CaC12激活過氧化氫酶原成為過氧化氫酶的同時加入飽和度的(NH4)2S04，使其生成硫酸鈣沉淀吸附過氧化氫酶，經過洗脫、鹽析、超濾和凍干獲得白色的過氧化氫酶的凍干粉末。產品均為過氧化氫酶，沒有單純的過氧化氫酶提取分離純化。
【發明內容】
[0004]本發明的目的就是為了生產高質量的過氧化氫酶而又降低生產成本，對傳統工藝加以改造，尤其是參數的改造，提供了一種提取過氧化氫酶方法。
[0005]本發明的技術方案是:利用硫酸溶液將肝臟細胞中含有的酶原提取出來，然后根據等電點沉淀的原理，調節PH，硫酸銨分級鹽溶、鹽析將過氧化氫酶原等沉淀析出，再將過氧化氫酶粗品溶解后，經鹽溶、鹽析，再用活性過氧化氫酶激活，被激活的酶溶液再經結晶透析、凍干的方法，即可得較高純度的過氧化氫酶，包括如下步驟:
1、過氧化氫酶粗制生產操作:
(1)提取工序:將新鮮的肝臟絞碎成肝漿，稱重。按每千克肝漿加入2~3L的
0.1-0.2mol/L硫酸溶液，浸漬20~28小時，將浸漬物置濾袋過濾，濾干后棄去濾渣，留取濾液；
(2)鹽溶工序:浸漬液中加入硫酸銨，達到30~50%飽和度，靜置10~16小時，過濾，留取濾液；
(3)鹽析工序:濾液中加入硫酸銨，達到50~80%飽和度，靜置10~16小時，過濾，留取濾餅；
(4)每克濾餅加入2~5ml的水溶解，重復上述(2)、(3)操作；
(5)每克濾餅用l~3ml的水溶解，然后每克濾餅中加入0.l~lml的飽和硫酸銨溶液，調節 pH 至 4.0-6.0 ； (6)結晶工序:溶液在20~30°C溫度中靜置24~72小時，有針狀糜蛋白酶結晶析出；離心，調節pH至2.0-5.0，每1000ml溶液中加300~400g固體硫酸銨，達到50~80%飽和度，靜置12~16小時，抽濾；
(7)干燥工序:取沉淀物，干燥，即得過氧化氫酶粗品。
[0006]2、過氧化氫酶精制生產操作:
(1)投料:稱取過氧化氫酶粗品，按每克過氧化氫酶粗品加2?4ml的水攪拌溶解，調節pH至3.0±0.5，以助其溶解，攪拌10?16小時；計量溶液體積，按400?500g/L比例加入固體硫酸銨，待其溶解后，靜置沉淀10?16小時；
(2)鹽溶:將溶液過濾，稱量濾餅重量，先按每克濾餅加入2~4ml的水，攪拌溶解后，調節pH至3.0±0.4，再按每克濾餅加入1?3ml的飽和硫酸銨溶液靜止沉淀10?16小時；
(3)鹽析:將溶液過濾，量取濾液體積，加入等體積量的飽和硫酸銨溶液，靜置沉淀10?16小時；
(4)洗鎂:將上清液棄去，沉淀物真空抽濾，并在濾餅上加入飽和硫酸鎂溶液，靜置1分鐘，抽濾，待濾液開始流出，將漏斗上剩余的硫酸鎂溶液傾去，將濾餅取出稱重，待活化；
(5)活化:稱濾餅重量為A千克，將濾餅溶于3A?5A升的0.001?0.01mol/L鹽酸溶液，另加入0.5?2mol/L氯化鈣溶液A?3A升及pH7.5?8.5硼酸緩沖液4A?6A升，再加入6A?9A升的水，調節pH至7.0?8.0，最后每克濾餅加5?15mg的結晶過氧化氫酶進行活化，將溶液置0?10°C中靜置60?80小時進行活化，pH控制在7.0?8.0 ;
(6)除鈣:活化后的溶液，調節pH至3.0±0.4，再按200?300g/L加入固體硫酸銨，攪拌溶解，在0?10°C中存放32?60小時使硫酸鈣沉淀，過濾，濾液按150?250g/L加入固體硫酸銨，在0?10°C中靜置10?14小時，過濾，得濾餅；
(7)結晶:按每克濾餅加入1?2mlpH8.0?10.0硼酸緩沖液，調節pH至8.0±0.4，攪拌均勻，再將溶液裝透析袋，0?10°C時浸于外透液中，結晶3?7天;
(8)透析:取出結晶液過濾得結晶物，再按每克結晶物加入1?3ml水溶解，調節pH至
3.0±0.5 ;將溶液透析2?4天，去除雜質，每10?14小時左右透析池換水一次，溫度控制在0?10°C ；
(9)凍干:取出透析液，加入少量硅藻土，抽濾，得濾液，調節pH至6.0±0.4，進凍干機凍干后得結晶過氧化氫酶成品。
[0007]與現有技術相比，本發明的優點和積極效果是:
本發明采用鹽析、多重結晶結合透析等技術來提取過氧化氫酶，通過對傳統工藝的改進和創新，不僅生產出了高質量的過氧化氫酶，同時又具有簡單、低成本等優點。
[0008]本發明已建立起一套規模化的生產工藝，制備的過氧化氫酶精品效價高達2500單位/毫克以上，符合《中國藥典》(2010版)要求，具有極大的市場競爭力。
【具體實施方式】
[0009]下面結合具體實施例對本發明做進一步說明。
[0010]實施例1
1、過氧化氫酶粗制生產操作:
1.提取工序: 1.1新鮮的肝臟，用鑷子和剪刀將脂肪結締組織等除去，置絞碎機中絞碎，稱重15Kg ;
1.2絞碎物置塑料桶中，用0.125mol/L硫酸溶液30L浸漬24小時，在浸漬期中每小時攪拌1次；
1.3將浸漬物置濾袋過濾，濾渣再用0.125mol/L硫酸溶液15L浸漬1小時，濾干后棄去濾渣；
2.鹽溶、鹽析工序:
2.1將兩次浸漬液合并，體積為44.9L，置塑料桶中，每1000ml溶液中加入固體硫酸銨242g，達到40%飽和度，共加10.866Kg固體硫酸銨，靜置12小時；
2.2過濾，留取過濾液，濾液體積為44L，固體棄去；
2.3在每1000ml清液中加入固體硫酸銨205g，達到70%飽和度，共用硫酸銨9.020kg，靜置12小時；
2.4過濾，留取濾餅，稱重269.2g，棄濾液；
2.5用807.6ml水溶解，再按2.1,2.2,2.3、2.4步驟分次加固體硫酸銨近40%和70%飽和度沉淀；
2.6取70%飽和度沉淀物，稱重178.5g，用267.8ml水溶解，加入89.3ml飽和硫酸銨溶液，并用5mol/L氫氧化鈉溶液調節pH至5.00 ;
2.7將溶液靜置25°C恒溫箱中48小時，有針狀的糜蛋白酶粗品結晶析出；
2.8過濾，母液用0.25mol/L硫酸調節pH至3.0，其體積為328.4ml加入硫酸銨100.8g，靜置12小時；
3.干燥工序:
取沉淀物，置真空干燥箱內干燥，即得過氧化氫酶粗品，稱重100.0g，即每千克肝臟可得6.67克過氧化氫酶。
[0011]2、過氧化氫酶精制生產操作:
1.投料
1.1稱取過氧化氫酶粗品100.0g，先用300ml純化水攪拌溶解，加2.5mol/L硫酸溶液調節pH至3.0，以助其溶解，攪拌12小時；
1.2計量溶液體積298.4ml，加入固體硫酸銨140.9g，待其溶解后，靜置沉淀12小時；1.3將溶液真空過濾，稱量濾餅重量96.6g，加純化水289.9ml，攪拌溶解后加2.5mol/L硫酸溶液調節pH至3.0，加入飽和硫酸銨溶液193.2ml，靜止沉淀12小時；
1.4將溶液過濾，量取濾液體積479.3ml，加入飽和硫酸銨溶液479.3ml，靜置沉淀12小時；
1.5洗鎂:將上清液棄去，沉淀物真空抽濾，并在濾餅上加入飽和硫酸鎂溶液，靜置1分鐘，抽濾，待濾液開始流出，將漏斗上剩余的硫酸鎂溶液傾去，將濾餅取出稱重93.3g，待活化；
2.活化
將濾餅溶于373.2ml0.005mol/L鹽酸溶液，另加入lmol/L氯化鈣溶液186.6ml及PH8.0硼酸緩沖液466.5ml，再加入746.4ml純化水，調節pH至7.4，最后加933mg活力較高的結晶過氧化氫酶進行活化處理，將溶液在5?10°C中靜置72小時進行活化，第二天測pH值為7.4 ; 3.除鈣
活化后的溶液用2.5mol/L硫酸溶液調節pH至3.1，溶液體積為1873ml，再加入固體硫酸銨455.2g，攪拌溶解，在0?10°C中存放48小時使硫酸鈣沉淀，過濾，濾液加入固體硫酸銨369.0g，在0?10°C靜置12小時，過濾，得濾餅重量45.6g ；
4.結晶
濾餅加入pH9.0硼酸緩沖液68.4ml，用2.5mol/L硫酸溶液調節pH至8.0，攪拌均勻，再將溶液裝透析袋，5?10°C浸于外透液中，結晶5天，每2小時搖包一次；
5.透析
取出結晶液過濾得結晶物28.7g，加純化水43.lml溶解，用2.5mol/L硫酸調節pH至
3.0 ;將溶液裝透析袋，然后掛于透析池中透析3天，去除鹽類雜質，每12小時左右透析池換水一次，溫度控制