一種鹽生杜氏藻中微量元素含量測定方法
【專利摘要】本發明公開了一種鹽生杜氏藻中β-胡蘿卜素和葉綠素a含量測定方法，屬水產養殖領域。β-胡蘿卜素含量測定傳統上是將β-胡蘿卜素標準品用石油醚-異丙醇混合液稀釋成系列濃度的標準品溶液，將所得的樣品溶液進行液相色譜分析，從而得知樣品中β-胡蘿卜素含量。該法結果準確，測試費用低，但耗時長，設備昂貴，操作繁瑣。海藻中葉綠素測定傳統上采用分光光度計法，操作麻煩，技術性強，設備昂貴。本發明公開的萃取法測定鹽生杜氏藻中β-胡蘿卜素和葉綠素a含量，操作簡便，耗時短，結果準確，費用低，可一次完成多個樣品的測定。
【專利說明】—種鹽生杜氏藻中微量元素含量測定方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于水產養殖領域，尤其涉及一種鹽生杜氏藻中β_胡蘿卜素和葉綠素a含量測定方法。
【背景技術】
[0002]鹽生杜氏藻Dunaliella salina為雙鞭毛單細胞綠藻，廣布于內陸鹽湖，可耐高鹽度(20-300%。)，個體較大(16-24 μ mX 10-13 μ m)，因能大量合成β-胡蘿卜素(最高可達干重的14%)而受到廣泛重視。胡蘿卜素是人體內維生素A的前體，可用于防治癌癥、心血管病及老年性癡呆等退行性疾病，還能作為高級天然色素用于食品加工。臨床試驗表明，鹽生杜氏藻提取的鹽藻素對調節血壓、降低血脂、降血糖、糖尿病、酒精肝、脂肪肝、胃潰瘍、胃炎、白內障、夜盲癥、干眼病有較好療效且可明顯提高機體免疫力。目前，澳大利亞、以色列、美國、中國、日本、西班牙、加拿大等已有幾十家公司從事鹽生杜氏藻生產。我國具有漫長的海岸線和星羅棋布的內陸鹽湖，具有培養鹽生杜氏藻生產β_胡蘿卜素得天獨厚的自然條件。
[0003]β_胡蘿卜素含量是衡量鹽生杜氏藻質量好壞的最重要指標，藻液中β_胡蘿卜素含量的測定一直是一個麻煩、費時、費事、費力、令人頭疼的工作。以前，鄧同樂發明了一種β_胡蘿卜素提取物中β_胡蘿卜素含量的定量檢測方法(專利號CN201410235214)，具體步驟是:1)將β_胡蘿卜素標準品用石油醚-異丙醇混合液稀釋成系列濃度的標準品溶液；2)稱取待測的β-胡蘿卜素提取物溶于石油醚-異丙醇混合液中，作為樣品溶液；3)將步驟I)所得的標準品溶液和步驟2)所得的樣品溶液分別進行高效液相色譜分析；從而分別獲得系列濃度的標準品溶液以及樣品溶液中胡蘿卜素的吸收峰面積比；4)建立β_胡蘿卜素標準曲線；5)將樣品溶液中胡蘿卜素的峰高代入步驟4)所得的曲線方程中，從而最終得知待測的β_胡蘿卜素提取物中β_胡蘿卜素的含量。該方法結果準切可靠，測試費用低，但耗時長，設備昂貴，操作繁瑣，技術要求高，效率低。
[0004]關于海藻中葉綠素測定方法，過去黃廷林曾公開了一種水生藻類葉綠素測定方法(專利號200410073542)，該方法用分光光度法測定水中藻類葉綠素含量，采用醋酸纖維微孔濾膜過濾水中藻類，用90%乙醇浸泡研磨截留了藻類的醋酸纖維膜，將藻類細胞中的葉綠素萃取到乙醇中，將萃取液離心獲得澄清液，以90%乙醇作參比，用分光光度計測定萃取液在630、647、664、750nm處的吸光度，利用測定數據計算水樣中葉綠素a、b、c的含量。劉春光也發明了一種水中浮游藻類葉綠素a的測定方法(專利號200610129454)，其原理和具體操作步驟與黃廷林的發明相近。他們的發明測定結果準確穩定，重現性好，安全無污染，但缺點也很明顯，操作麻煩，技術性強，對測試人員要求高，設備昂貴，儀器投資大，實用性不強。
[0005]為了克服傳統方法的缺點，我發明了一種萃取法測定鹽生杜氏藻中胡蘿卜素和葉綠素a含量方法，該法操作簡便，技術性要求不高，耗時短，結果準確，費用低，可一次完成多個樣品的測定。
【發明內容】
[0006]為了克服目前技術的不足，本發明提供了一種鹽生杜氏藻中胡蘿卜素和葉綠素a含量測定方法，方法如下:
[0007]β -胡蘿卜素含量的測定方法
[0008]步驟I將鹽生杜氏藻培養至第13天時，藻細胞密度可達到250X 104-400X 14Cell/每暈升，用移液管移取藻液100暈升，裝入250暈升的三角燒瓶中；
[0009]步驟2加入15克NaCl，加入80%乙二醇(由乙二醇和蒸餾水按80: 20體積比混合而成)120毫升，保鮮膜封口，橡皮筋扎緊，放在搖床上搖勻20分鐘，充分萃取；
[0010]步驟3此時液體分成上清液和下濁液，用20毫升的移液管移取上清液，加入到250毫升的容量瓶中，用80%乙二醇定容至250毫升；
[0011]步驟4轉入250毫升圓底燒瓶中，在搖床上搖勻60分鐘，用721型分光光度計測定在波長425nm時的吸光值OD425，用下式計算β -胡蘿卜素含量
[0012]β -胡蘿卜素含量(mg/L)=(最后定容體積X 9.84X OD425) + (2.91X藻液取樣體積)
[0013]最后算出的β -胡蘿卜素含量單位是(mg/L)，即每升藻液中含有的β -胡蘿卜素毫克數。葉綠素a含量的測定方法
[0014]步驟5將鹽生杜氏藻培養至第9天時，藻細胞密度可達到150 X 104-300 X 14Cell/每暈升，用量筒取藻液200暈升藻液,倒入500暈升的三角燒瓶中；
[0015]步驟6加入20克硫酸亞鐵，加入240毫升85%的丁酮(由丁酮和蒸餾水按85: 15體積比混合而成)，保鮮膜封口，橡皮筋扎緊，放在搖床上搖勻25分鐘，充分萃取；
[0016]步驟7此時液體分成明顯的上下兩層，上層清亮，下層渾濁，用移液管取上清液至500毫升的容量瓶中，用85%丁酮定容至500毫升，轉入1000毫升燒杯中，保鮮膜封口，橡皮筋扎緊，置于搖床上搖勻15分鐘；
[0017]步驟8用分光光度計分別測定波長624nm和725nm時的吸光值OD624、OD725，用下式計算葉綠素a含量
[0018]葉綠素a含量(mg/L) = [(19.62X0D624+4.83 X OD725) +藻液取樣體積]X最后定容體積最后算出的葉綠素a含量單位是mg/L，即每升藻液中含有的葉綠素a毫克數。
[0019]有益結果
[0020]關于β-胡蘿卜素含量的測定方法，鄧同樂曾發明了一種胡蘿卜素提取物中β_胡蘿卜素含量的定量檢測方法(專利號CN201410235214)，該方法結果準切可靠，測試費用低，但耗時長，設備昂貴，操作繁瑣，技術要求高，效率低。關于海藻中葉綠素測定方法，過去黃廷林曾公開了一種水生藻類葉綠素測定方法(專利號200410073542)，劉春光也發明了一種水中浮游藻類葉綠素a的測定方法(專利號200610129454)，他們的發明測定結果準確穩定，重現性好，安全無污染，測試費用低，但缺點也很明顯:操作麻煩，技術性強，對測試人員要求高，設備昂貴，儀器投資大，實用性不強。為了克服傳統方法的缺點，我發明了一種鹽生杜氏藻中胡蘿卜素和葉綠素a含量測定方法，本發明操作簡便，技術性要求不高，耗時短，結果準確，費用低，可一次完成多個樣品的測定。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021]圖1為鹽生杜氏藻中β -胡蘿卜素測定具體操作流程；
[0022]圖2為鹽生杜氏藻中葉綠素a含量測定具體操作流程。
【具體實施方式】
[0023]β -胡蘿卜素含量的測定方法
[0024]1)步驟1將鹽生杜氏藻培養至第13天時，藻細胞密度可達到250X 104-400X 104cell/每暈升，用移液管移取藻液100暈升，裝入250暈升的三角燒瓶中；
[0025]2)步驟2加入15克NaCl，加入80%乙二醇(由乙二醇和蒸餾水按80: 20體積比混合而成)120毫升，保鮮膜封口，橡皮筋扎緊，放在搖床上搖勻20分鐘，充分萃取；
[0026]3)步驟3此時液體分成上清液和下池液，用20暈升的移液管移取上清液,加入到250毫升的容量瓶中，用80%乙二醇定容至250毫升；
[0027]4)步驟4轉入250毫升圓底燒瓶中，在搖床上搖勻60分鐘，用721型分光光度計測定在波長425nm時的吸光值0D425，用下式計算β -胡蘿卜素含量β -胡蘿卜素含量(mg/L)=(最后定容體積X9.84X0D425) + (2.91 X藻液取樣體積)最后算出的β-胡蘿卜素含量單位是(mg/L)，即每升藻液中含有的β_胡蘿卜素毫克數。葉綠素a含量的測定方法
[0028]5)步驟5將鹽生杜氏藻培養至第9天時，藻細胞密度可達到150X 104-300X 104cell/每暈升，用量筒取藻液200暈升藻液，倒入500暈升的三角燒瓶中；
[0029]6)步驟6加入20克硫酸亞鐵，加入240毫升85%的丁酮(由丁酮和蒸餾水按85: 15體積比混合而成)，保鮮膜封口，橡皮筋扎緊，放在搖床上搖勻25分鐘，充分萃取；
[0030]7)步驟7此時液體分成明顯的上下兩層，上層清亮，下層渾濁，用移液管取上清液至500毫升的容量瓶中，用85%丁酮定容至500毫升，轉入1000毫升燒杯中，保鮮膜封口，橡皮筋扎緊，置于搖床上搖勻15分鐘；
[0031]8)步驟8用分光光度計分別測定波長624nm和725nm時的吸光值0D624、0D725，用下式計算葉綠素a含量
[0032]葉綠素a含量(mg/L) = [ (19.62 X 0D624+4.83 X 0D725) +藻液取樣體積]X最后定容體積最后算出的葉綠素a含量單位是mg/L，即每升藻液中含有的葉綠素a毫克數；
[0033]9)步驟2、3所用NaCl、乙二醇和步驟6、7所用硫酸亞鐵、丁酮等化學藥品純度均需分析純級別而非化學純或試劑純；
[0034]10)步驟2、6所用蒸餾水如果用三蒸水代替更好；
[0035]11)步驟1至7中所用三角燒瓶、燒杯、圓底燒瓶、容量瓶和移液管等玻璃儀器均需洗刷干凈，后用蒸餾水潤洗3遍，最后在50°C烘箱中烘干使用。
[0036]即一種鹽生杜氏藻中β -胡蘿卜素和葉綠素a含量測定方法，方法如下:
[0037]β -胡蘿卜素含量的測定方法
[0038]步驟1將鹽生杜氏藻培養至第13天時，藻細胞密度可達到250X 104-400X 104cell/每暈升，用移液管移取藻液100暈升，裝入250暈升的三角燒瓶中；
[0039]步驟2加入15克NaCl，加入80%乙二醇(由乙二醇和蒸餾水按80: 20體積比混合而成)120毫升，保鮮膜封口，橡皮筋扎緊，放在搖床上搖勻20分鐘，充分萃取；
[0040]步驟3此時液體分成上清液和下濁液，用20毫升的移液管移取上清液，加入到250毫升的容量瓶中，用80%乙二醇定容至250毫升；
[0041]步驟4轉入250毫升圓底燒瓶中，在搖床上搖勻60分鐘，用721型分光光度計測定在波長425nm時的吸光值0D425，用下式計算β -胡蘿卜素含量
[0042]β -胡蘿卜素含量(mg/L)=(最后定容體積X9.84X0D425) + (2.91X藻液取樣體積)
[0043]最后算出的β -胡蘿卜素含量單位是(mg/L)，即每升藻液中含有的β -胡蘿卜素毫克數。葉綠素a含量的測定方法
[0044]步驟5將鹽生杜氏藻培養至第9天時，藻細胞密度可達到150 X 104_300 X 104cell/每暈升，用量筒取藻液200暈升藻液,倒入500暈升的三角燒瓶中；
[0045]步驟6加入20克硫酸亞鐵，加入240毫升85%的丁酮(由丁酮和蒸餾水按85: 15體積比混合而成)，保鮮膜封口，橡皮筋扎緊，放在搖床上搖勻25分鐘，充分萃取；
[0046]步驟7此時液體分成明顯的上下兩層，上層清亮，下層渾濁，用移液管取上清液至500毫升的容量瓶中，用85%丁酮定容至500毫升，轉入1000毫升燒杯中，保鮮膜封口，橡皮筋扎緊，置于搖床上搖勻15分鐘；
[0047]步驟8用分光光度計分別測定波長624nm和725nm時的吸光值0D624、0D725，用下式計算葉綠素a含量
[0048]葉綠素a含量(mg/L) = [ (19.62 X 0D624+4.83 X 0D725) +藻液取樣體積]X最后定容體積最后算出的葉綠素a含量單位是mg/L，即每升藻液中含有的葉綠素a毫克數。
[0049]最后應說明的是:以上實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其限制；盡管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，本領域的普通技術人員應當理解:其依然可以對前述實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發明實施例技術方案的精神和范圍。
【權利要求】
1.一種鹽生杜氏藻中微量元素含量測定方法，其特征在于步驟如下: 所述微量元素為β -胡蘿卜素和葉綠素a, 1)β_胡蘿卜素含量的測定方法 步驟I將鹽生杜氏藻培養至第13天時，藻細胞密度可達到2 50 X 104-400 X 14Cell/每暈升，用移液管移取藻液100暈升,裝入250暈升的三角燒瓶中； 步驟2加入15克NaCl，加入80%乙二醇(由乙二醇和蒸餾水按80: 20體積比混合而成)120毫升，保鮮膜封口，橡皮筋扎緊，放在搖床上搖勻20分鐘，充分萃取； 步驟3此時液體分成上清液和下池液,用20暈升的移液管移取上清液,加入到250暈升的容量瓶中，用80%乙二醇定容至250毫升； 步驟4轉入250毫升圓底燒瓶中，在搖床上搖勻60分鐘，用721型分光光度計測定在波長425nm時的吸光值OD425，用下式計算β -胡蘿卜素含量 β -胡蘿卜素含量(mg/L)=(最后定容體積X 9.84 X OD425) + (2.91 X藻液取樣體積) 最后算出的β_胡蘿卜素含量單位是(mg/L)，即每升藻液中含有的β-胡蘿卜素毫克數； 2)葉綠素a含量的測定方法 步驟5將鹽生杜氏藻培養至第9天時，藻細胞密度可達到150X 104-300X 14Cell/每暈升，用量筒取藻液200暈升藻液,倒入500暈升的三角燒瓶中； 步驟6加入20克硫酸亞鐵，加入240毫升85%的丁酮(由丁酮和蒸餾水按85: 15體積比混合而成)，保鮮膜封口，橡皮筋扎緊，放在搖床上搖勻25分鐘，充分萃取； 步驟7此時液體分成明顯的上下兩層，上層清亮，下層渾濁，用移液管取上清液至500毫升的容量瓶中，用85 %丁酮定容至500毫升，轉入1000毫升燒杯中，保鮮膜封口，橡皮筋扎緊，置于搖床上搖勻15分鐘； 步驟8用分光光度計分別測定波長624nm和725nm時的吸光值0D624、OD725，用下式計算葉綠素a含量 葉綠素a含量(mg/L) = [ (19.62 X 0D624+4.83 X OD725) +藻液取樣體積]X最后定容體積最后算出的葉綠素a含量單位是mg/L，即每升藻液中含有的葉綠素a毫克數。
【文檔編號】G01N21/31GK104406922SQ201410648082
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年11月17日 優先權日:2014年11月17日
【發明者】王培磊 申請人:臨沂大學