本發明屬于醫學生物類免疫檢測試劑領域，具體涉及一種快速診斷神經元特異性烯醇化酶試劑盒及其使用方法。
背景技術：
：神經元特異性烯醇化酶(neuron-specificenolase，NSE)是一種肝糖分解酶，特異性存在于神經元、周圍神經組織和神經內分泌組織內，其他臟器及腦脊液中的分布水平不及中樞神經系統的1％。當神經元或神經內分泌細胞發生缺血、缺氧、中毒或損傷時，細胞膜的完整性受到破壞，NSE從損傷的細胞內“漏出”，最先進入腦脊液中，通過破壞的血腦脊液屏障進入血液循環，導致NSE在外周血和腦脊液中的濃度明顯升高，因此NSE是中樞神經系統損害的標志物，通過檢測血清或腦脊液中NSE的變化，為證實顱腦損傷的發生、判斷顱腦損傷的程度、預測患者的預后提供了依據。此外，NSE在小細胞肺癌和神經母細胞瘤等內分泌腫瘤中顯示出很高的免疫活性，許多研究者相繼證明，NSE用于小細胞肺癌診斷，是一個具有高特異性和高靈敏性的腫瘤標記物，其特異性高達80～90％，診斷靈敏度達80％；當應用NSE作神經母細胞瘤鑒別診斷時，其陽性率可達96～100％。因此，通過檢測血清中的NSE，對于小細胞肺癌和神經母細胞瘤的檢測療效和預報復發均具有重要的參考價值。監測患者血清中NSE含量的動態變化還可作為預測癌細胞是否有腦轉移趨勢的一個重要指標。因此，NSE是監測神經系統疾病和腫瘤的重要標志物，提供一種能準確、快速檢測NSE的方法滿足臨床診斷和科研的需要，具有重要意義。我國目前獲準上市的NSE國產和進口檢測試劑盒約7個品種，檢測原理主要有酶聯免疫法(ELISA)、化學發光免疫法(CLIA)、電化學發光免疫法(ECLI)和時間分辨免疫熒光法(TRFIA)等。其中，傳統的酶聯免疫分析自動化程度不高，操作過程繁瑣，受人為操作因素影響很大，不利于高通量的全自動檢測，特異性和靈敏性有待提高，已逐漸被其他三種檢測手段取代。新興的化學發光免疫分析、電化學發光免疫分析和時間分辨免疫熒光分析具有靈敏度高、線性范圍寬、分析速度快、操作簡便、容易實現自動化的優點，是理想的臨床微量生化檢驗的分析手段。但目前，具有自主知識產權的國產NSE檢測試劑盒較少，且大部分均基于酶聯免疫分析而設計的，涉及上述三種新興檢測手段的試劑盒更為少見，均依靠國外進口，價格昂貴，給患者帶來很大經濟負擔，不利于基層普及。基于此，國內本領域的學者致力于NSE試劑盒的研發，如崔曉丙等人在“神經元特異性烯醇化酶(NSE)時間分辨免疫熒光免疫分析試劑盒的臨床性能評價”(現代醫學儀器與應用，2008,20(1),4-7)中披露采用自制的時間分辨免疫熒光免疫分析試劑盒檢測血清中的NSE，與進口Roche電化學發光試劑盒檢測比較，兩者測定值接近，相關系數為0.973，達到國外進口的水平。又如賀安等人在“神經元特異性烯醇化酶光激化學發光免疫分析法的建立”(現代免疫學，2011,31(1),44-47)中披露采用自制的光激化學發光免疫分析快速檢測試劑盒檢測血清中的NSE，與進口Roche電化學發光試劑盒檢測比較，兩者測定值接近，相關系數為0.979，達到國外進口的水平。除了上述所述的幾種檢測手段外，國內學者也嘗試將不同的技術手段結合，開發出使用更為簡便，具有更高檢測靈敏度和特異性地試劑盒，如公開號為CN102914650B的中國專利申請“神經元特異性烯醇化酶定量檢測試劑盒及其制備方法與應用”以免疫磁珠微粒與化學發光技術相結合，可實現樣本和試劑一次加入，大大簡化了檢測程序，縮短檢測時間，并達到較佳的性能參數。又如公開號為CN103175964B的中國專利申請“神經元特異性烯醇化酶定量檢測試劑盒及其制備方法”以化學交聯法將NSE單克隆體和多克隆抗體復合包被粒徑為80-240nm的膠乳顆粒，保證檢測試劑盒具有高靈敏度及較寬的檢測線性范圍，且操作簡便、快速、特異性強、穩定性好。電化學發光免疫法(ECLI)檢測是在化學發光和電化學基礎上發展而來的一種分析方法，其通過在電極上施加一定電壓以引發電化學反應，電化學反應釋放的能量再激發發光體，當激發態發光體返回基態時便產生光發射，從而可以根據光發射強度來實現對待測物的分析。目前基于電化學發光免疫分析原理的檢測儀器已成功商品化，如羅氏診斷公司(RocheDiagnostics)的Roche型電化學發光免疫分析儀及其配套試劑盒，采用釕聯吡啶衍生物作為標記探針，磁珠為反應載體，并結合自動化的試劑傳輸系統，可快速檢測多種疾病標志物。但基于電化學發光免疫技術用于檢測NSE的國產試劑盒的研究相對較少，不能滿足國內需求。技術實現要素：為解決現有技術存在的問題，本發明的目的在于提供一種快速診斷神經元特異性烯醇化酶試劑盒，采用該試劑盒進行NSE檢測具有較高的靈敏度和特異性，且操作簡單，操作流程短。本發明另外一個目的在于提供一種所述快速診斷神經元特異性烯醇化酶試劑盒的使用方法。本發明的上述目的是通過以下技術方案實現的：本發明提供了一種快速診斷神經元特異性烯醇化酶試劑盒，其包含神經元特異性烯醇化酶標準品、反應緩沖液、清洗液、脂質體復合物、磁性分離試劑。所述的脂質體復合物為內部包裹有聯吡啶釕Ru(bpy)32+和納米金粒子復合物，表面包被有抗神經元特異性烯醇化酶抗體，所述的納米金粒子為粒徑在2～50nm的類球形納米金。所述的磁性分離試劑由生物素化合的抗神經元特異性烯醇化酶抗體和鏈霉親和素包被的磁性微粒制備而成。本發明提供的試劑盒為夾心法電化學發光免疫分析法與磁性微粒分離技術相結合的一種檢測方法，基本原理為：利用脂質體將發光物質(Ru(bpy)32+和納米金粒子復合物)進行包裹，并進行脂質體表面抗體化結合，制備脂質體復合物；利用生物素與鏈霉親和素的相互作用，將生物素化的抗體與鏈霉親和素包被的磁性微粒進行絡和，制備磁性分離試劑；將脂質體復合物、待測物質(抗原)、磁性分離試劑混合，在室溫下充分反應，形成磁性微粒-抗原-脂質體復合物的“三明治”結構，在外磁場的作用下，磁性微粒-抗原-脂質體復合物吸附于電極表面，加入反應緩沖液，使脂質體復合物釋放出發光物質，所述的發光物質再次吸附于電極表面，開啟電壓后，發光底物及反應參與物在電極表面失去電子而被氧化。電子供體失去一個H+而成為強還原劑，將發光底物還原為激發態，隨即釋放光子而恢復為基態的發光底物。這一過程在電極表面周而復始地進行，不斷地發出光子而常保持底物濃度的恒定。根據本發明的具體實施方案，本發明的快速診斷神經元特異性烯醇化酶試劑盒中，所述的脂質體復合物的制備包括以下步驟：(1)按質量比為(4～10):1的比例分別取Ru(bpy)32+和納米金粒子，利用靜電吸附作用，將帶正電荷的Ru(bpy)32+吸附于帶負電荷的納米金粒子上，制得Ru(bpy)32+和納米金粒子復合物；(2)將Ru(bpy)32+和納米金粒子復合物溶于Tris緩沖溶液中，制成質量濃度為2％的溶液，所述的Tris-HCl緩沖溶液含有10mM三羥甲基氨基甲烷和15mM氯化鈉，pH為7.2；(3)取二硬脂酰磷脂酰膽堿、膽固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，混合，溶于5mL的氯仿中，超聲處理5min，然后在28℃，0.1MPa的條件下旋轉蒸發，除去氯仿，靜置30min，然后加入1mLRu(bpy)32+和納米金粒子復合物溶液，在60℃水浴中振蕩反應約1h，得脂質體懸浮液，將脂質體懸浮液超聲處理3min，然后使用注射器式濾器調整脂質體的粒徑至90～100nm，得到內部包裹有Ru(bpy)32+和納米金粒子復合物的脂質體；(4)取1mL內部包裹有Ru(bpy)32+和納米金粒子復合物的脂質體與1mL質量濃度為2％的1,5-戊二醛溶液混合，室溫下反應2h，然后用10mMpH7.2的PBS溶液進行透析12～24h，以除去多余的1,5-戊二醛，然后在4℃下，加入抗神經元特異性烯醇化酶抗體，所述抗體在體系中的終濃度為10μg/mL，孵育12h，加入2％(w/v)BSA，繼續孵育12h，以阻斷脂質體表面上的非特異性位點，將得到的脂質體復合物置于4℃保存，即得。其中，所述步驟(3)中二硬脂酰磷脂酰膽堿、膽固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的摩爾比為20:10:4。本發明通過大量的試驗發現，使用脂質體包裹發光物質Ru(bpy)32+體系的穩定性好，但檢測靈敏度有待提高，通過大量的試驗最終確定，將發光物質Ru(bpy)32+吸附于粒徑為2～50nm的納米金粒子上，形成Ru(bpy)32+和納米金粒子復合物，可顯著增強發光強度，提高檢測靈敏度。根據本發明的具體實施方案，本發明的快速診斷神經元特異性烯醇化酶試劑盒中，所述的生物素化合的抗神經元特異性烯醇化酶抗體的制備包括以下步驟：取抗神經元特異性烯醇化酶抗體溶于pH為7.2的PBS緩沖液中，制成濃度為1.0～2.0mg/mL的溶液；另取EZ-LinkSulfo-NHS-LC-biotin溶于pH為7.2的PBS緩沖液中，制成濃度為10～50mM的溶液；然后取1mL濃度為1.0～2.0mg/mL的抗神經元特異性烯醇化酶抗體溶液與25μL的濃度為10～50mM的EZ-LinkSulfo-NHS-LC-biotin溶液混合，置于室溫中反應1～2h，再使用PD-10的凝膠過濾器進行過濾，即得生物素化合的抗神經元特異性烯醇化酶抗體。根據本發明的具體實施方案，本發明的快速診斷神經元特異性烯醇化酶試劑盒中，所述的鏈霉親和素包被的磁性微粒的制備包括以下步驟：取0.5mg金磁微粒，磁性分離棄上清，加入150～200μg鏈霉親和素，加入0.1mol/LpH為7.4的Tris-HCl緩沖液0.5mL，置振蕩器中室溫條件下反應1～2h，去上清，用含1mmol/LEDTA且濃度為0.1mol/L、pH為7.4的Tris-HCl清洗液反復清洗，制得鏈霉親和素包被的磁性微粒。根據本發明的具體實施方案，本發明的快速診斷神經元特異性烯醇化酶試劑盒中，所述的磁性分離試劑的制備包括以下步驟：取1mL生物素化合的抗神經元特異性烯醇化酶抗體與200μg的鏈霉親和素包被的磁性微粒混合，在室溫條件下，100r/min反應1～2h，反應結束后，磁性分離，去上清，加入pH為7.4的Tris-HCl緩沖液反復洗滌多次，然后加入1mL濃度為0.2～0.4mM的D-生物素水溶液，室溫下反應30min，以充分阻斷未與生物素化合的抗神經元特異性烯醇化酶抗體結合的鏈霉親和素位點，反應結束后，磁性分離，去上清，用pH為7.4的Tris-HCl緩沖液反復洗滌多次以除去多余的D-生物素，加入含2％(w/v)BSA、0.1％(v/v)吐溫-20、pH為7.2的PBS溶液復溶，即得磁性分離試劑。本發明將鏈霉親和素包被的磁性微粒，并用生物素標記捕獲抗體，利用生物素和鏈霉親和素的相互作用，將生物素標記抗體和鏈霉親和素包被的磁性微粒免疫結合，延長抗體在磁性微粒上的臂展和正確定向，整體上提高了試劑盒的靈敏度，制得的磁性分離試劑穩定性良好，保存有效期延長。進一步地，本發明所述的反應緩沖液的組成為：0.1mol/L三丙胺、0.1mol/L磷酸二氫鉀、0.1mol/L氯化鈉、0.1％(v/v)吐溫-20、1％(v/v)TritonX-100，pH為7.0～7.2。所述的清洗液為含0.1％(v/v)吐溫-20、0.1mol/L氯化鈉，且濃度為0.05mol/L、pH為7.2的磷酸鹽緩沖溶液。上述的反應緩沖液中磷酸二氫鉀主要起緩沖作用，維持反應體系的pH值，添加吐溫-20和TritonX-100可增強發光作用，提高發光效率，減少三丙胺的用量，提高試劑盒的使用安全性。本發明還提供了神經元特異性烯醇化酶系列濃度的標準液，所述的神經元特異性烯醇化酶標準品的制備包括以下步驟：使用含0.1mol/L磷酸二氫鉀、0.1mol/L氯化鈉、2％(w/v)BSA、0.1％(v/v)吐溫-20的溶液將神經元特異性烯醇化酶抗原配制成濃度分別為5，25，75，150，300，600ng/ml的標準液，即得。作為優選，本發明試劑盒還可進一步包含質控品，所述質控品的配制同標準品，所述質控品中神經元特異性烯醇化酶抗原的濃度分別為75ng/ml和300ng/ml。進一步地，本發明還提供了一種所述的神經元特異性烯醇化酶試劑盒的使用方法，其包括以下步驟：(1)使用含2％(w/v)BSA的PBS緩沖液將脂質體復合物按1:5的比例進行稀釋；(2)取25μL稀釋后的脂質體復合物、25μL磁性分離試劑、50μL待測樣本或神經元特異性烯醇化酶標準品，混合，在室溫條件下渦旋1h，充分反應，形成磁性微粒-抗原-脂質體復合物，將反應液吸入電化學反應池中，所述的磁性微粒-抗原-脂質體復合物通過磁性吸附于電極表面，加入100μL清洗液輕輕潤洗電極表面3次，去清洗液，然后加入500μL反應緩沖液，使脂質體內聯吡啶釕Ru(bpy)32+和納米金粒子復合物溶出，溶出的聯吡啶釕Ru(bpy)32+和納米金粒子復合物通過磁性再次吸附于電極表面，電化學工作站通電，啟動ECL反應，通過光電倍增管收集電化學發光信號；(3)測定梯度濃度的神經元特異性烯醇化酶標準液的發光強度變化值，根據發光強度變化值對數與相應的濃度對數繪制反應曲線，計算待測標本中神經元特異性烯醇化酶的濃度。本發明試劑盒中提及的各種緩沖溶液，除另有注明外，均為市售產品，未提及的試劑盒的外包裝以及各試劑組分的獨立包裝容器等均可以按照所屬領域的常規操作進行，符合相關行業規定即可。本發明的方法中未詳細提及的操作步驟也可參照所屬領域的常規操作進行，所用檢測儀器設備，如電化學分析儀的使用按說明書操作進行。與現有技術相比，本發明的優勢在于：(1)與常規的電化學發光免疫檢測方法比較，本發明以夾心法電化學發光免疫分析法與磁性微粒分離技術相結合，形成磁性微粒-抗原(待測物)-脂質體復合物的“三明治”結構，大大提高了檢測的特異性和靈敏度，降低變異系數，與干擾物質交叉反應小，具有較寬的檢測線性范圍，檢測結果可靠。(2)分別采用本發明提供的試劑盒與Roche型電化學發光免疫分析試劑盒對經元特異性烯醇化酶進行檢測，兩者測定值接近，相關系數為0.984，達到國外進口的水平，但成本遠低于進口試劑，適合大規模推廣和應用。(3)本發明將發光物質聯吡啶釕Ru(bpy)32+和納米金粒子進行復合，顯著增強發光強度，提高檢測靈敏度，并將形成的復合物包裹于脂質體內部，顯著提高檢測的穩定性。(4)采用本發明提供的試劑盒對神經元特異性烯醇化酶進行檢測，操作簡單，耗時少，大大提高檢測的效率。(5)本發明提供的試劑盒中各試劑穩定性好，儲存時間較長，且毒性低，對操作人員的健康影響小。具體實施方式以下通過具體實施方式進一步描述本發明，但本發明不僅僅限于以下實施例。實施例1本發明檢測試劑盒的組成與制備本發明所述的試劑盒包括以下組分：試劑a：神經元特異性烯醇化酶標準品試劑b：反應緩沖液試劑c：脂質體復合物試劑d：磁性分離試劑試劑e：清洗液作為優選，本發明試劑盒還可進一步包含質控品，所述質控品的配制同標準品。所述的脂質體復合物為內部包裹有聯吡啶釕Ru(bpy)32+和納米金粒子復合物，表面包被有抗神經元特異性烯醇化酶抗體，其中，所述的納米金粒子為粒徑在2～50nm的類球形納米金。所述的磁性分離試劑由生物素化合的抗神經元特異性烯醇化酶抗體和鏈霉親和素包被的磁性微粒制備而成。本發明試劑盒中各試劑的制備包括以下步驟：(1)神經元特異性烯醇化酶標準品制備原料廠家磷酸二氫鉀深圳卓越生物科技有限公司氯化鈉深圳卓越生物科技有限公司BSASigma-Aldrich西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司吐溫-20上海麥克林生化科技有限公司神經元特異性烯醇化酶抗原天健生物制藥(天津)有限公司制備方法：使用含0.1mol/L磷酸二氫鉀、0.1mol/L氯化鈉、2％(w/v)BSA、0.1％(v/v)吐溫-20的溶液將神經元特異性烯醇化酶抗原配制成濃度分別為5，25，75，150，300，600ng/ml的標準液，即得。(2)反應緩沖液原料廠家三丙胺Sigma-Aldrich西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司TritonX-100Sigma-Aldrich西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司其他試劑的來源見上表。制備方法：以配制100ml反應緩沖液為例：取1.43g三丙胺、1.36g磷酸二氫鉀、0.58g氯化鈉溶于100ml水中，加入0.1ml吐溫-20、1mlTritonX-100，攪拌均勻，調節pH為7.2，即得反應緩沖液。(3)清洗液原料廠家磷酸二氫鈉深圳卓越生物科技有限公司磷酸氫二鈉深圳卓越生物科技有限公司其他試劑的來源見上表。制備方法：以配制100ml清洗液為例：①取0.599g磷酸二氫鈉溶于100ml水中，制成濃度為0.05mol/L的磷酸二氫鈉溶液，另取0.710g磷酸氫二鈉溶于100ml水中，制成濃度為0.05mol/L的磷酸氫二鈉溶液，分別取0.05mol/L的磷酸二氫鈉溶液28ml，0.05mol/L的磷酸氫二鈉溶液72ml，混合，制得濃度為0.05mol/L、pH為7.2的磷酸鹽緩沖溶液。②取0.58g氯化鈉、0.1ml吐溫-20，加入100ml濃度為0.05mol/L、pH為7.2的磷酸鹽緩沖溶液，攪拌均勻即得。(4)脂質體復合物原料廠家聯吡啶釕上海譜振生物科技有限公司納米金膠體南京先豐納米材料科技有限公司二硬脂酰磷脂酰膽堿Avantipolarlipids,lnc膽固醇Avantipolarlipids,lnc二硬脂酰磷脂酰乙醇胺Avantipolarlipids,lnc神經元特異性烯醇化酶抗體上海谷研科技有限公司Tris-HCl緩沖溶液南京森貝伽生物科技有限公司1,5-戊二醛上海阿拉丁生化科技股份有限公司制備方法：①按質量比為6:1的比例分別取Ru(bpy)32+和納米金粒子，利用靜電吸附作用，將帶正電荷的Ru(bpy)32+吸附于帶負電荷的納米金粒子上，制得Ru(bpy)32+和納米金粒子復合物；②將Ru(bpy)32+和納米金粒子復合物溶于Tris緩沖溶液中，制成質量濃度為2％的溶液，所述的Tris緩沖溶液含有10mM三羥甲基氨基甲烷和15mM氯化鈉，pH為7.2；③按摩爾比為20:10:4分別稱取二硬脂酰磷脂酰膽堿、膽固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，混合，溶于5mL的氯仿中，超聲處理5min，然后在28℃，0.1MPa的條件下旋轉蒸發，除去氯仿，靜置30min，然后加入1mLRu(bpy)32+和納米金粒子復合物溶液，在60℃水浴中振蕩反應約1h，得脂質體懸浮液，將脂質體懸浮液超聲處理3min，然后使用注射器式濾器調整脂質體的粒徑至90nm，得到內部包裹有Ru(bpy)32+和納米金粒子復合物的脂質體；④取1mL內部包裹有Ru(bpy)32+和納米金粒子復合物的脂質體與1mL質量濃度為2％的1,5-戊二醛溶液混合，室溫下反應2h，然后用10mMpH7.2的PBS溶液進行透析12h，以除去多余的1,5-戊二醛，然后在4℃下，加入抗神經元特異性烯醇化酶抗體，所述抗體在體系中的終濃度為10μg/mL，孵育12h，加入2％(w/v)BSA，繼續孵育12h，以阻斷脂質體表面上的非特異性位點，將得到的脂質體復合物置于4℃保存，即得。(5)磁性分離試劑原料廠家PBS緩沖液南京森貝伽生物科技有限公司EZ-LinkSulfo-NHS-LC-biotin皮爾斯生物技術有限公司金磁微粒西安金磁納米生物技術有限公司鏈霉親和素德國默克公司D-生物素皮爾斯生物技術有限公司制備方法：①生物素化合的抗神經元特異性烯醇化酶抗體的制備：取抗神經元特異性烯醇化酶抗體溶于pH為7.2的PBS緩沖液中，制成濃度為1.0mg/mL的溶液；另取EZ-LinkSulfo-NHS-LC-biotin溶于pH為7.2的PBS緩沖液中，制成濃度為10mM的溶液；然后取1mL濃度為1.0mg/mL的抗神經元特異性烯醇化酶抗體溶液與25μL的濃度為10mM的EZ-LinkSulfo-NHS-LC-biotin溶液混合，置于室溫中反應2h，再使用PD-10的凝膠過濾器進行過濾，即得生物素化合的抗神經元特異性烯醇化酶抗體。②鏈霉親和素包被的磁性微粒的制備：取0.5mg金磁微粒，磁性分離棄上清，加入150μg鏈霉親和素，加入0.1mol/LpH為7.4的Tris-HCl緩沖液0.5mL，置振蕩器中室溫條件下反應2h，去上清，用含1mmol/LEDTA且濃度為0.1mol/L、pH為7.4的Tris-HCl清洗液反復清洗，制得鏈霉親和素包被的磁性微粒。③磁性分離試劑的制備：取1mL生物素化合的抗神經元特異性烯醇化酶抗體與200μg的鏈霉親和素包被的磁性微粒混合，在室溫條件下，100r/min反應2h，反應結束后，磁性分離，去上清，加入pH為7.4的Tris-HCl緩沖液反復洗滌多次，然后加入1mL濃度為0.2mM的D-生物素水溶液，室溫下反應30min，以充分阻斷未與生物素化合的抗神經元特異性烯醇化酶抗體結合的鏈霉親和素位點，反應結束后，磁性分離，去上清，用pH為7.4的Tris-HCl緩沖液反復洗滌多次以除去多余的D-生物素，加入含2％(w/v)BSA、0.1％(v/v)吐溫-20、pH為7.2的PBS溶液復溶，即得磁性分離試劑。實施例2采用本發明檢測試劑盒進行神經元特異性烯醇化酶檢測(1)待測樣本的準備：樣本的采集參照常規操作，具體為將采集的靜脈血加入至試管或肝素抗凝管中，離心，取上清部分進行實驗；(2)使用含2％(w/v)BSA的PBS緩沖液將脂質體復合物按1:5的比例進行稀釋；(3)取25μL稀釋后的脂質體復合物、25μL磁性分離試劑、50μL待測樣本或神經元特異性烯醇化酶標準品，混合，在室溫條件下渦旋1h，充分反應，形成磁性微粒-抗原-脂質體復合物，將反應液吸入電化學反應池中，所述的磁性微粒-抗原-脂質體復合物通過工作電極下面的磁鐵吸附于電極表面，加入100μL清洗液輕輕潤洗電極表面3次，去清洗液，然后加入500μL反應緩沖液，使脂質體內聯吡啶釕Ru(bpy)32+和納米金粒子復合物溶出，溶出的聯吡啶釕Ru(bpy)32+和納米金粒子復合物通過磁性再次吸附于電極表面，電化學工作站通電，啟動ECL反應，通過光電倍增管收集電化學發光信號；(4)測定梯度濃度的神經元特異性烯醇化酶標準液的發光強度變化值，根據發光強度變化值對數與相應的濃度對數繪制反應曲線，計算待測標本中神經元特異性烯醇化酶的濃度。對比例1檢測試劑盒的組成與制備對比例1檢測試劑盒的組成和制備與實施例1檢測試劑盒的組成和制備基本相同，區別在于，所述的脂質體復合物為內部不含粒徑在2～50nm的類球形納米金，僅包裹有聯吡啶釕Ru(bpy)32+，表面包被有抗神經元特異性烯醇化酶抗體。實施例3本發明檢測試劑盒的方法學檢定按照本領域中常規的制造和檢定規程對實施例1制得的檢測試劑盒進行檢定，結果如下：①線性關系以自制試劑盒中參考標準品濃度的對數為橫坐標，信號值計數的對數為縱坐標，由雙對數數學模型Log-Log函數處理，測得NSE試劑盒劑量-反應曲線線性相關系數為r＝0.9983，表明自制試劑盒在濃度為5-600ng/ml的范圍內具有良好的劑量反應線性關系。②最低檢出限重復測定零校準品(或樣本稀釋液)不少于10次，計算出反應量的均值(x)和標準差(s)，將(x+2s)的反應量代入劑量-反應曲線，計算出相應濃度值，即為最低檢出限，所得自制試劑盒的最低檢出限為0.01ng/ml。③精密度以自制試劑盒中3個不同濃度的參考標準品進行測定(高、中、低濃度分別為25ng/ml、150ng/ml、600ng/ml)，各設10個復孔。分別對同一批次和不同批次的自制試劑盒中3個不同濃度的參考標準品進行重復測定10次。結果自制試劑盒的批內變異系數(CV％)為1.4～2.8％，批間變異系數(CV％)為3.2～5.7％，符合試劑盒檢定規程要求，精密度良好。④特異性以人非神經元烯醇化酶(NNE)1000ng/ml和脂蛋白相關磷脂酶A2(Lp-PLA2)500ng/ml作為待測樣品，用自制的NSE試劑盒測定，檢測結果分別為0.18ng/ml、0.06ng/ml，無明顯的交叉反應，表明自制的試劑盒對檢測NSE特異性高。⑤穩定性將自制的檢測試劑盒置于37℃分別熱處理0天、3天、5天和7天，在不同的處理時間之后分別測定NSE校準品，各時間點的試劑盒信號值變化不大，線性關系良好，表明本發明檢測試劑盒具有良好的熱穩定性。實施例4本發明檢測試劑盒與進口Roche型電化學發光免疫分析試劑盒測定結果比較分別采用本發明自制的試劑盒和羅氏診斷公司(RocheDiagnostics)的Roche型電化學發光免疫分析試劑盒同時對30份樣本進行檢測。用自制試劑盒檢測血清中的NSE的分析靈敏度、精密度、穩定性和線性范圍的結果，與國外Roche型電化學發光免疫分析試劑盒比較均無明顯差異，結果見下表。并以自制試劑盒測定的結果為橫坐標，Roche試劑盒測定的結果為縱坐標做回歸分析，相關方程為：Y＝0.836X+0.492，相關系數r＝0.984。結果表明本發明自制試劑盒測定結果與Roche試劑盒測定結果具有高度相關性，兩者的最低檢測限相當，但本發明自制試劑盒的線性范圍較寬，且批間、批內精密度較優。實施例5對比例1試劑盒和本發明實施例1制得的試劑盒對神經元特異性烯醇化酶進行檢測的結果比較對比例1試劑盒的使用方法參考實施例2具體的步驟。分別采用對比例1試劑盒和實施例1試劑盒同時對肺癌患者血清樣本40份(NSE陽性率為100％)進行檢測，結果見下表。結果表明，對比例1制得的試劑盒對血清中NSE檢測的靈敏度降低，檢測的線性范圍縮窄，批內和批間精密度降低，將發光物質Ru(bpy)32+吸附于粒徑為2～50nm的納米金粒子上，形成Ru(bpy)32+和納米金粒子復合物，可顯著提高檢測靈敏度和檢測精密度，使檢測具有較寬的線性范圍。以上僅是本發明的優選實施方式，應當指出的是，上述優選實施方式不應視為對本發明的限制，本發明的保護范圍應當以權利要求所限定的范圍為準。對于本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明的精神和范圍內，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。當前第1頁1 2 3