一種誘導形成神經元的方法和組合物的制作方法

一種誘導形成神經元的方法和組合物的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種誘導形成神經元的方法和組合物。本發明提供了一種特異性誘導膠質細胞分化形成神經元的方法，具體地，首先將NeuroD1基因構建在病毒載體上，包裝獲得帶有NeuroD1的假病毒顆粒，并通過NeuroD1假病毒顆粒感染膠質細胞后，經過一段時間的培養，即可將膠質細胞分化為神經元細胞。所獲得的神經元細胞及其組合物，能夠在神經退行性疾病如帕金森病等的治療中有潛在價值。
【專利說明】一種誘導形成神經元的方法和組合物
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，具體地涉及一種特異性誘導膠質細胞轉化成神經元細胞的方法和組合物。
【背景技術】
[0002]干細胞在生物醫學領域中有著十分廣闊的應用前景，胚胎干細胞具有全面分化的潛能，成為研究的熱點， 但干細胞的研究面臨倫理上眾多質疑，嚴重的影響了對于干細胞的研究。
[0003]1997年英國科學家Wilmut等人將羊體細胞的細胞核轉入去核的卵母細胞中并發育成成熟的個體——著名的多利羊，從而在實踐中證實了體細胞逆轉成為全能干細胞的可能性，但卵母細胞通常難以獲得，對卵母細胞的顯微操作技術要求非常高，這無疑影響了干細胞的研究。
[0004]2006年，日本科學家Takahashi和Yamanaka發現4個轉錄因子(0ct_4、Sox_2、Klf4和c-Myc)共同作用小鼠皮膚細胞后，能夠成功的將其誘導逆轉分化為可以向三個胚層分化的多能干細胞，2007年Takahashi和Yamanaka利用這四個轉錄因子成功的將人的表皮細胞誘導分化形成多功能干細胞。Takahashi和Yamanaka所用的技術被稱為誘導多功能干細胞(iPS)技術，他們的研究使人類向再生醫學及疾病治療的夢想又邁進了一步。盡管Takahashi和Yamanaka的研究成為了干細胞研究領域中的一個里程碑，但在實際操作中必須經歷從體細胞誘導獲得多功能干細胞，再從多功能干細胞基礎上定向分化為目的靶細胞。整個過程步驟多、周期長，失敗率高，所分化的細胞還具有腫瘤形成的潛在危險，這些問題不利于該技術的推廣和應用。
[0005]2010年Wernig實驗室首次在Nature上報道了通過小鼠的體細胞直接誘導獲得具有功能性的類似神經元細胞，開啟了神經科學領域的研究的新篇章。作者首先對神經組織進行基因分析，獲得了 19個特異的基因，構建并包裝成為慢病毒顆粒；通過用這19個基因慢病毒感染小鼠胚胎成纖維細胞，培養數日后發現神經元特異性基因Tujl表達；隨后將基因范圍縮小至Brn2、Ascll和Mytll (簡稱BAM)三個基因上；檢測誘導的細胞的一些特征:基因表達，免疫熒光，突觸電位等；實驗結果表明，通過誘導小鼠成纖維細胞可以獲得具有神經元形態和功能的類神經元細胞。2011年Wernig實驗室通過Brn2、Ascll、Mytll和NeuroDl四個轉錄因子，將人的成纖維細胞誘導形成功能性神經元細胞。這些研究簡化了從體細胞誘導到多功能干細胞再定向分化為神經元的繁瑣途徑，為神經生物學研究提供了更為有效的工具。
[0006]帕金森病主要是因位中腦部位〃黑質〃區中的神經元細胞發生病變，多巴胺的合成減少、抑制乙酰膽堿的功能降低而造成的，病變之后，神經元數量減少、功能下降，該區域將會被膠質細胞所“占領”，如果能夠讓這些膠質細胞再變回為神經元細胞，那么也許對于帕金森病的治療有一定的幫助作用。
[0007]綜上，本領域迫切需要開發簡便有效誘導形成神經元的方法和組合物
【發明內容】

[0008]本發明目的為提供一種簡便有效的誘導形成神經元的方法和組合物。
[0009]在本發明的第一方面，提供了一種NeuroDl基因或NeuroDl蛋白的用途，用于制備誘導膠質細胞形成神經元的組合物；或制備治療神經退行性疾病的組合物。
[0010]在另一優選例中，所述的組合物包括藥物組合物。
[0011]在本發明的第二方面，提供了一種假病毒顆粒，所述假病毒顆粒具有以下特征:
[0012](a)攜帶外源的NeuroDl的編碼序列；
[0013](b)可感染膠質細胞，并且在膠質細胞中表達外源的NeuroDl轉錄因子。
[0014]在另一優選例中，所述的NeuroDl來源于人。
[0015]在另一優選例中，所述的假病毒顆粒選自下組慢病毒、腺病毒、皰疹病毒、或痘病 毒。
[0016]在另一優選例中，所述的假病毒顆粒是如下制備的:
[0017]將攜帶NeuroDl的編碼序列的載體導入假病毒顆粒的包裝細胞中，從而形成假病
毒顆粒。
[0018]在本發明的第三方面，提供了一種表達盒，所述表達盒從5’至3’依次包括以下元件:
[0019]膠質細胞特異性的啟動子、NeuroDl的編碼序列、終止密碼子。
[0020]在另一優選例中，所述的膠質細胞特異性的啟動子包括:GFAP啟動子(GFAP，膠質纖維酸性蛋白)和HRE-GFAP雜合啟動子(HRE，低氧反應元件)。
[0021]在另一優選例中，NeuroDl來源于哺乳動物，優選人。
[0022]在本發明的第四方面，提供了一種表達載體，所述的表達載體含有本發明第三方面中所述的表達盒。
[0023]在另一優選例中，所述的表達載體包括質粒、病毒載體。
[0024]在另一優選例中，所述的病毒載體包括慢病毒載體、腺病毒載體、皰疫病毒載體、痘病毒載體、或腺相關病毒載體。
[0025]在本發明的第五方面，提供了一種藥物組合物，所述的組合物包括(i)藥學上可接受的載體以及(ii)本發明第四方面所述的表達載體或本發明第二方面所述的假病毒顆粒。
[0026]在本發明的第六方面，提供了一種本發明第四方面所述表達載體或本發明第二方面所述的假病毒顆粒的用途，它們被用于制備誘導膠質細胞形成神經元的組合物；或制備治療神經退行性疾病的組合物。
[0027]在本發明的第七方面，提供了一種誘導膠質細胞形成神經元細胞的方法，包括步驟:
[0028]在外源NeuroDl蛋白存在下，培養膠質細胞，從而誘導膠質細胞形成神經元細胞。
[0029]在另一優選例中，所述的外源NeuroDl蛋白包括在培養體系中添加的NeuroDl蛋白，或在所述膠質細胞內表達外源NeuroDl編碼序列而產生的外源NeuroDl蛋白。
[0030]應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1顯示了用于構建NeuroDl慢病毒載體的載體FUGW的結構圖。
[0032]圖2顯示了被NeuroDl慢病毒感染后的U87細胞的免疫熒光圖(明視野200x，藍色為DAPI染色)。結果顯示，被感染的細胞已經表達Tujl蛋白。
[0033]圖3顯示了未感染NEUR0D1慢病毒的U87細胞的免疫熒光圖(熒光視野200x，紅色為Tujl染色)。結果顯示，未表達Tujl蛋白。
【具體實施方式】
[0034]本發明人經過長期深入的研究，首次意外地發現，NeuroDl單基因可有效地誘導膠質細胞形成神經元細胞。本發明人將NeuroDl基因構建在病毒載體上，包裝獲得帶有NeuroDl的假病毒顆粒，并通過NeuroDl假病毒顆粒感染膠質細胞后，經過一段時間的培養，即可將膠質細胞誘導分化為神經元細胞。在此基礎上，完成了本發明。
[0035]啟動子
[0036]在本發明中，可用的啟動子沒有特別限制，為一段位于結構基因5’端上游區的DNA序列，能活化RNA聚合酶，有與NeuroDl模板DNA準確地相結合并具有轉錄起始的特異性。可以選自組成性因子、誘導性因子和組織特異性因子。更佳地為組織特異性啟動子，如膠質細胞特異性啟動子，可在膠質細胞中特異性啟動遺傳物質的轉錄。
[0037]NeuroD 1基因和蛋白
[0038]NeuroDl，神經分化因子1，又名B細胞E盒轉錄激活因子2 (BETA-2)，屬于組織特異性的B類bHLH蛋白，作為轉錄因子，NeuroD-Ι基因是β細胞特異和有效表達胰島素基因所必需。
[0039]基因名稱:NEUR0D1物種:人源；轉錄本的Genbank編號:NM 002500。
[0040]NEUROD 1的氨基酸序列的登錄號為NP 002491.2，具體序列如下:
[0041]MTKSYSESGL MGEPQPQGPP SWTDECLSSQ DEEHEADKKE DDLEAMNAEE DSLRNGGEEE 60
[0042]DEDEDLEEEE EEEEEDDDQK PKRRGPKKKK MTKARLERFK LRRMKANARE RNRMHGLNM 120
[0043]LDNLRKVVPC YSKTQKLSKI ETLRLAKNYI WALSEILRSG KSPDLVSFVQ TLCKGLSQPT 180
[0044]TNLVAGCLQL NPRTFLPEQN QDMPPHLPTA SASFPVHPYS YQSPGLPSPP YGTMDSSHVF 240
[0045]HVKPPPHAYS AALEPFFESP LTDCTSPSFD GPLSPPLSIN GNFSFKHEPS AEFEKNYAFT 300
[0046]MHYPMTLAG AQSHGSIFSG TMPRCEIPI DNIMSFDSHS HHERVMSAQL NAIFHD356
[0047](SEQ ID N0.: 1)
[0048]應理解，在本發明中，術語“NeuroDl基因和蛋白”不僅包括野生型和突變型的NeuroDl基因和蛋白，還包括NeuroDl蛋白的活性片段或活性衍生蛋白(以及相應的編碼序列)，只要所述活性片段或活性衍生蛋白仍具有野生型NeuroDl蛋白的基本功能(例如保留≥50%,≥70%以上野生型Neurol蛋白活性)。
[0049]NeuroDl基因可用常規方法(如PCR或全合成)獲得，然后導入載體，轉入宿主細胞，從而表達獲得NeuroDl蛋白。此外，NeuroDl基因或克隆還可購買獲得，例如可購自OriGene公司(貨號SC118625)購得。[0050]病毒載體
[0051]在本發明中，一種優選的載體是病毒載體。本發明的病毒載體可以將膠質細胞直接誘導形成神經元。
[0052]用于本發明的病毒載體沒有特別限制，可以是任何能夠利用病毒具有傳送其基因組的特點，將遺傳物質帶入其他細胞，進行感染的病毒載體。可發生于完整活體或是細胞培養中。包括慢病毒載體、腺病毒載體、皰疫病毒載體、痘病毒載體。
[0053]—種優選的病毒載體是慢病毒載體。在本發明的一個實例中，通過PCR技術將NeuroDl基因構建到FUGW慢病毒載體上，從而形成FUGW-NEUR0D1慢病毒載體。
[0054] 一種特別優選的病毒載體是假病毒顆粒。在本領域中，制備假病毒顆粒的方法是本領域技術人員熟知的，例如采用包裝細胞來生產假病毒顆粒。
[0055]在本發明的一個實例中，一種NeuroDl慢病毒載體的包裝方法包括:將載體系統中的FUGW-NEUR0D1慢病毒載體、pCMV_dR8.2dvpr載體和pCMV_VSV_G載體共同轉染宿主細胞后，即可在宿主細胞中包裝獲得NEUR0D1慢病毒顆粒。宿主細胞為293T細胞。
[0056]體外誘導方法
[0057]本發明還提供了一種體外的、非治療性的將膠質細胞直接誘導成神經元的方法。一種通過NeuroDl慢病毒顆粒誘導膠質細胞的方法包括步驟:通過NeuroDl慢病毒感染膠質細胞，感染后的細胞維持培養20天以上，從而形成神經元。
[0058]經誘導所形成的神經元細胞，可通過免疫熒光進行檢測，例如，用神經元特異性蛋白Tujl的抗體來檢測，從而鑒別出神經元細胞。
[0059]藥物組合物以及給藥方式
[0060]本發明還提供一種可用于將非神經元細胞(如膠質細胞)誘導形成神經元的組合物。本發明的藥物組合物還可治療或預防神經退行性疾病。
[0061]本發明藥物組合物包括本發明上述的表達載體或假病毒顆粒和藥學上可接受的載體。
[0062]在本發明的藥物組合物，通常含有106_1012PFU/ml的假病毒顆粒，較佳地107-1012PFU/ml的假病毒顆粒，更佳地109-10nPFU/ml的假病毒顆粒。
[0063]“藥學上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。
[0064]術語指這樣一些藥劑載體:它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領域普通技術人員所熟知的。在組合物中藥學上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、緩沖液。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質，如填充劑、潤滑劑、助流劑、潤濕劑或乳化劑、pH緩沖物質等。所述的載體中還可以含有細胞轉染試劑。
[0065]通常，將所述表達載體或假病毒顆粒和藥學上可接受的載體混合后，即可獲得的本發明的藥物組合物。
[0066]本發明所述的組合物的給藥方式沒有特別限制，代表性的例子包括(但并不限于):靜脈注射、皮下注射、腦部注射等。
[0067]本發明的有益效果包括:
[0068]1.本發明僅需包裝NeuroDl —個轉錄因子至病毒載體，即可將膠質細胞誘導分化成神經元細胞，解決了只有將多個轉錄因子導入載體才能獲得功能性神經元的步驟。
[0069]2.本發明簡化了將體細胞誘導為多功能干細胞，再定向分化為神經元的繁瑣途徑。
[0070]3.啟動子為膠質細胞識別特異性啟動子，遺傳物質的轉錄僅在膠質細胞中進行，避免了感染其他細胞的可能。
[0071]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆:實驗室手冊(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數是重量百分比和重量份數。
[0072]實驗材料
[0073]1.載體:
[0074]載體名稱:FUGW(購自Addgene公司，貨號14883)
[0075]兀件順序:Ubiquitinpromoter-MCS-GFP-ffRE
[0076]克隆位點:BamHI/AgeI
[0077]載體圖譜:如圖1所示。
[0078]2.擴增引物:
[0079]正向:
[0080]aggtcgactc tagaggatcc cgccaccatg accaaatcgt acagcga(SEQ ID N0.:2)
[0081]反向:`
[0082]agtccatggt ggcgaccgga tcatgaaata tggcattgag c(SEQ ID N0.:3)
[0083]3.細胞
[0084]3.1.293T 細胞:
[0085]購自美國ATCC。細胞轉染用胰蛋白酶消化對數生長期的293T細胞，細胞密度為1.2X107細胞/20ml (0.6X109/L)時，重新接種于15cm的細胞培養皿，37°C、5%C02培養箱內培養，細胞密度達70%~80%時轉染。轉染24h前將細胞培養基更換為無血清培養基。
[0086]3.2 膠質細胞 U87:
[0087]購自美國ATCC。用胰蛋白酶消化對數生長期的U87細胞，細胞密度為1.2X107細胞/20ml (0.6X109/L)時，重新接種于24孔的細胞培養皿，37°C、5%C02培養箱內培養
[0088]實施例1
[0089]NeuroDl慢病毒載體的構建:
[0090](1)以通過NEUR0D1 cDNA克隆為模板，通過擴增引物進行PCR反應，擴增獲得大小
1.1Kb左右的PCR產物。
[0091 ] (2)對PCR產物和病毒載體進行BamHI和Agel的雙酶切。
[0092](3)過T4 DNA連接酶(購自Takara公司)連接后進行轉化反應。
[0093](4)通過對轉化子的鑒定，挑選陽性克隆送測，以測序序列和預期序列一致的作為正確克隆，命名為FUGW-NEUR0D1慢病毒載體。
[0094]實施例2
[0095]NeuroDl慢病毒載體的包裝:
[0096](1)制備慢病毒包裝系統中3種質粒的DNA溶液(FUGW-NEUR0D1慢病毒載體 20 μ g，pCMV-dR8.2 dvpr 載體(購自 Addgene) 15 μ g, pCMV-VSV-G 載體(購自Addgene) 10 μ g,與相應體積的Opti_MEM混合均勻稀釋,調整總體積為2.5ml,在室溫下溫育5分鐘。
[0097](2)取 100 μ lLipofectamine2000 (購自 invitrogen)試劑在另一管中與 2.4mlOpt1-MEM(購自invitrogen)混合稀釋,在室溫下溫育5分鐘。
[0098](3)把(1)中所述稀釋后的DNA與(2)中所述稀釋后的Lipofectamine2000進行混合，5分鐘內輕輕地顛倒混勻。室溫下溫育20min。
[0099](4)將DNA與Lipofectamine 2000混合液轉移至293T細胞的培養液中，混勻，于37°C、5%C02細胞培養箱中培養。培養8h后倒去含有轉染混和物的培養基，每瓶細胞加入20ml的PBS液，輕輕左右晃動一下培養瓶以洗滌殘余的轉染混和物，然后倒去。
[0100](5)每瓶細胞中加入含10%血清的細胞培養基25ml，于37°C、5%C02培養箱內繼續培養48小時。
[0101](6)收集轉染48小時后的293T細胞上清液。于4°C，4000g離心lOmin，除去細胞碎片。以0.45 μ m濾器過濾上清液于40ml超速離心管中。把病毒粗提液樣品加入到過濾杯中并蓋上蓋子，將過濾杯插到濾過液收集管中。組合好后，做好平衡，放在轉頭上。在4000g離心約10-15分鐘。離心結束后，取出離心裝置，將過濾杯和下面的濾過液收集杯分開。樣品收集杯中的即為病毒濃縮液。
[0102](7)將病毒濃縮液移出，分裝后保存在病毒管中，-80度長期保存。所獲得的病毒命名為NEUR0D1慢病毒顆粒。
[0103]實施例3
[0104]NeuroDl慢病毒誘導膠質細胞；
[0105](1)當膠質細胞U87密度達50%~60%時進行病毒感染，感染前將細胞培養基更換為無血清培養基。
[0106](2)根據U87細胞的Μ0Ι值(M0I=5)，加入適宜量的NEUR0D1慢病毒(加入病毒數=細胞數X Μ0Ι值)。12h后觀察細胞狀態:如果沒有明顯的細胞毒性作用，繼續培養24h后更換培養基；如果有明顯的細胞毒性作用，立即更換培養基。
[0107](3)培養基更換:當U87細胞被NEUR0D1慢病毒感染后三天時，使用帶有N27因子(Invitrogen, 17504-044,)的 Neurobasal 培養基(Invitrogen, 12348-017)逐步替換原有的培養基。替換方法，每次保留1/2的原有培養基，加入1/2的新鮮的帶有N27因子的Neurobasal培養基，每三天更換一次培養基，確保細胞生長狀態良好。
[0108](4)細胞維持:病毒感染后的U87細胞需要持續培養20天以上，在此期間需要對細胞進行定期換液。
[0109]實施例4
[0110]對所誘導的神經元細胞的免疫熒光檢測；
[0111]將持續培養20天以上的感染后U87細胞進行免疫熒光實驗，實驗步驟如下:
[0112](1)洗滌:用TBS輕輕清洗細胞，洗三次，以去除細胞中的雜質；
[0113](2)固定步驟:新鮮配好的4%多聚甲醛固定常溫20分鐘；
[0114](3)洗滌:預冷的TBS洗三遍，每遍5分鐘；
[0115](4)透膜:吸干液體，用0.2%Triton-X室溫10分鐘。
[0116](5)洗滌:TBS洗三遍，每遍5分鐘；[0117](6)封閉:加 200μ 12%BSA，室溫 1 小時。
[0118](7) 一抗孵育:β 3-Tubulin (TU-20)Mouse mAb (Cell Signaling Technology,#4466)，加100 μ 1 一抗(1:200),用1%BSA配抗體，4度過夜，或者37度2小時。
[0119](8)洗滌:洗一抗，TBS每次10分鐘，洗三次，注意:一定要覆蓋玻片表面，盡量洗干凈。
[0120]以下步驟均在暗室操作
[0121](9) 二抗孵育:(暗室操作)Alexa Fluor 546 Donkey Ant1-MouseIgG(Invitrogen，A10036)，加 100 μ 1 二抗(1:500)，閉光，室溫孵育 1 小時。
[0122](10)洗滌:(暗室操作)洗二抗，TBS每次10分鐘，洗三次，注意:一定要覆蓋玻片表面，盡量洗干凈，避光。
[0123](11)封片:(暗室操作)用VECTASHIEIjy的DAPI染色劑(4’，6- 二脒基-2-苯基口引哚4’，6-diamidino-2-phenylindole,是一種能夠與DNA強力結合的突光染料)(H-1200)(3ng/mL)，室溫10分鐘；注意:盡量不要有氣泡；玻片放上后就不能再移動。
[0124](12)拍照:使用熒光顯微鏡拍照:
[0125]NEUROD 1慢病毒感染后的U87細胞，再維持20天以上時，通過神經元特異性蛋白Tujl的免疫熒光實驗，結果表明U87細胞已經表達Tujl蛋白(如圖2)，說明此時的U87細胞已經具備了神經元的特性。而未感染NEUR0D1慢病毒的U87細胞則無法檢測到Tujl的表達(如圖3)。
[0126]這表明，NEUR0D1慢病毒感染膠質細胞后，可以誘導膠質細胞表達神經元特異性蛋白，使得所誘導的膠質細胞具備了神經元特性。
[0127]實施例5
[0128]構建膠質細胞中特異性表達的表達盒和載體
[0129]GFAP啟動子和HRE-GFAP雜合啟動子是已知的可在膠質細胞中特異性表達的啟動子。在本實施例中，以構建好的FUGW-NEUR0D1慢病毒載體為基礎，構建膠質細胞特異表達的慢病毒載體。具體的方法如下:
[0130]FUGff-NEUROD 1載體中用于啟動NEUROD 1的ub i qui t in啟動子從載體中通過酶切的方法切除，插入PCR擴增獲得的膠質特異性啟動子-GFAP啟動子或HRE-GFAP啟動子，從而獲得含有以下表達盒的NEUROD 1慢病毒載體:
[0131](a)GFAP啟動子-NeuroDl的編碼序列-終止密碼子；
[0132](b) HRE-GFAP雜合啟動子-NeuroDl的編碼序列-終止密碼子。
[0133]所述的表達盒可在膠質細胞中特異性表達NeuroDl蛋白。
[0134]測試結果表明，含該組織特異性表達盒的慢病毒載體感染膠質細胞后，同樣可誘導膠質細胞表達神經元特異性蛋白(Tujl蛋白)，使得所誘導的膠質細胞具備了神經元特性。此外，該含該組織特異性表達盒的慢病毒載體感染表皮細胞后，不表達外源的NeuroDl蛋白。
[0135]討論:
[0136]本發明提供了一種特異性誘導膠質細胞分化形成神經元的方法，具體地，首先將NeuroDl基因構建在病毒載體上，包裝獲得帶有NeuroDl的假病毒顆粒，并通過NeuroDl假病毒顆粒感染膠質細胞后，經過一段時間的培養，即可將膠質細胞分化為神經元細胞。神經退行性疾病是由于神經元衰老和死亡后膠質細胞占據了主導地位，從而阻斷了神經元之間的電生理反應。NEUROD 1慢病毒可以將膠質細胞誘導形成神經元細胞，NEUR0D1病毒載體在神經退行性疾病(例如帕金森病等)的治療中具有潛在價值，通過將膠質細胞誘導為神經元后將中斷的神經網絡進行修復，從而減輕病人的痛苦。
[0137]在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
【權利要求】
1.一種NeuroDl基因或NeuroDl蛋白的用途,其特征在于,用于制備誘導膠質細胞形成神經元的組合物；或制備治療神經退行性疾病的組合物。
2.一種假病毒顆粒，其特征在于，所述假病毒顆粒具有以下特征:(a)攜帶外源的NeuroDl的編碼序列；(b)可感染膠質細胞，并且在膠質細胞中表達外源的NeuroDl轉錄因子。
3.如權利要求2所述的假病毒顆粒，其特征在于，所述的假病毒顆粒選自下組慢病毒、腺病毒、皰疫病毒、或痘病毒。
4.一種表達盒，其特征在于，所述表達盒從5’至3’依次包括以下元件:膠質細胞特異性的啟動子、NeuroDl的編碼序列、終止密碼子。
5.如權利要求4所述的表達盒，其特征在于，所述的膠質細胞特異性的啟動子包括:GFAP啟動子和HRE-GFAP雜合啟動子；和/或NeuroDl來源于哺乳動物，優選人。
6.一種表達載體，其特征在于，所述的表達載體含有權利要求4所述的表達盒。
7.如權利要求6所述的表達載體，其特征在于，所述的表達載體包括質粒、病毒載體；更佳地，所述的病毒載體包括慢病毒載體、腺病毒載體、皰疫病毒載體、痘病毒載體、或腺相關病毒載體。
8.—種藥物組合物，其特征在于，所述的組合物包括(i)藥學上可接受的載體以及(?)權利要求6所述的表達載體或權利要求2所述的假病毒顆粒。
9.一種權利要求6所述的表達載體或權利要求2所述的假病毒顆粒的用途，其特征在于，用于制備誘導膠質細胞形成神經元的組合物；或制備治療神經退行性疾病的組合物。
10.一種誘導膠質細胞形成神經元細胞的方法，其特征在于，包括步驟:在外源NeuroDl蛋白存在下，培養膠質細胞，從而誘導膠質細胞形成神經元細胞。
【文檔編號】C12N15/861GK103667190SQ201210330915
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月7日 優先權日:2012年9月7日
【發明者】高博, 盛一, 謝勝華, 吳慶, 徐述 申請人:上海吉凱基因化學技術有限公司