本發明涉及組織處理。
背景技術：
用于診斷疾病過程的取自身體的組織常常在組織學實驗室中被處理以產生薄的組織切片，所述組織切片可以被封固在載片上并且在顯微鏡下由病理學家觀察以進行分析。這些分析前處理按順序一般包括肉眼檢查固定、脫水、透明化、石蠟浸潤以及包埋。所述程序用于處理組織，包括活檢標本、在手術時取出的更大的標本、或來自尸檢的組織。
肉眼檢查一般由以下步驟組成：描述宏觀標本以及將它的全部或所選擇的部分放入到當所述組織被處理成石蠟塊時容納所述組織的小的塑料盒中。最初，將所述盒放入到固定劑中。
在肉眼檢查后，將組織固定。固定的目的在于通過改變蛋白質的結構以使得不發生由自溶引起的降解而將組織永久地保存在盡可能如活組織的狀態。多種固定劑可供使用，這取決于存在的組織類型以及待展現的特征。根據作用機制分類的主要固定劑組包括醛、汞劑、醇、氧化劑以及苦味酸鹽。福爾馬林固定最好是在約中性ph值，例如在6-8范圍之內進行。組織缺氧傾向于降低ph值，因此固定劑應當有緩沖能力以防止過度的酸性。常見的緩沖劑包括磷酸鹽、碳酸氫鹽、蘋果酸鹽、卡可基酸鹽、以及佛羅那(veronal)。市售的福爾馬林例如可以用ph7的磷酸鹽緩沖。組織的滲透取決于每一種單獨的固定劑的擴散性。一種提高固定劑的滲透的方式是薄地獲得(切割)組織(2至3毫米(mm))。向薄組織切片中滲透將比向厚切片滲透更快地發生。固定劑的體積一般是重要的，固定劑與通常針對的組織的比為10:1或更大。在固定劑中攪拌標本也常常將增強固定。
一旦組織已經被固著或固定，所述組織就需要被處理成如下的形式，其中它可以被制成薄切片以進行顯微鏡檢查。這樣做的通常的方式是使用石蠟。將組織包埋于石蠟中，所述石蠟為組織提供固體支持基質，從而允許它以約2微米至20微米的厚度被切片。將固定的組織放入石蠟中以進行切片被稱作組織處理，在這一處理中主要的步驟是脫水、透明化、浸潤以及包埋。
在水溶液中固定的組織不能用石蠟直接浸潤。首先，必須通過脫水去除組織中的水。這可以用一系列不同濃度(例如70％至95％至100％)的醇來進行。或者，用福爾馬林和醇的混合物進行脫水。還可以使用其它脫水劑，如丙酮或不同溶劑的混合物。
在脫水后，將組織透明化。“透明化”由用與包埋介質(例如石蠟)可混溶的物質去除脫水劑和一些脂質組成。最常見的透明劑是二甲苯。
一旦被透明化，就用諸如石蠟的包埋劑浸潤組織。最后，將處于盒中的組織或從它的盒中取出的組織放入熔融的石蠟中，然后將石蠟冷卻以形成包埋或包封組織的凝固塊以使得它可以被切片。或者，組織可以在可切片的盒中被處理，連同所述盒一起被包埋于石蠟中并且被切片。一旦組織已經被包埋于固體石蠟塊中，就可以將所述組織切割成可以被放在載片上的切片。這個步驟用切片機進行。一旦切下切片，就將它們漂浮在溫水浴上，所述溫水浴有助于去除任何褶皺。然后將處于石蠟中的組織切片從水浴中取出并且放在玻璃顯微鏡載片上。
技術實現要素：
在一個實施方案中，公開了一種組合物，所述組合物包括縮醛溶劑，所述組合物可操作或適用于處理取自身體的生物樣品。用于診斷或研究的取自身體的生物樣品如組織，包括但不限于，活檢標本、在手術時取出的標本和/或來自尸檢的組織。還公開了一種方法，所述方法包括用包括縮醛的組合物處理取自身體的用于診斷的生物樣品。在這方面，在一個實施方案中，處理生物樣品關注于所述生物樣品的分析前處理，如固定、透明化和/或包埋以進行后續的檢查/診斷。
適用于用于處理生物樣品的組合物的代表性縮醛包括甲縮醛、乙縮醛、丁縮醛、二氧戊環、甘油縮甲醛、乙醛縮二乙醇以及其混合物。二氧戊環是一種特別優選的縮醛溶劑。如本文所述的二氧戊環包括1,3-二氧戊環以及它的加合物和其混合物。這樣的加合物包括但不限于2-甲基-1,3-二氧戊環；4-甲基-1,3-二氧戊環；2,2-二甲基-1,3-二氧戊環；2-甲基-1,3-二氧戊環；4-甲基-2-苯基-1,3-二氧戊環(苯甲醛丙二醇)、1,2-二氧戊環以及其加合物。1,3-二氧戊環是一種特別優選的二氧戊環，這是因為它具有有利的毒性特征和商業可得性。
在一個實施方案中，包括二氧戊環的組合物用于組織學實驗室中的處理以產生可以在顯微鏡下觀察以進行分析的顯微鏡載片。在一個實施方案中，包括二氧戊環的組合物可以單獨或與例如醇、丙酮、二甲苯或二醇組合(單獨或作為混合物)用作脫水劑。在另一個實施方案中，包括二氧戊環的組合物可以在固定處理之后單獨或與醇組合(單獨或作為混合物)用作脫水劑。更進一步，包括二氧戊環的組合物可以與例如添加劑如石蠟一起用于浸潤處理中以提高石蠟在組織中的浸潤。
作為透明劑，包括二氧戊環的組合物可以100％濃度(例如100％二氧戊環組合物)使用或可以更低的組成與另外的一種或多種透明劑如烴透明劑(例如二甲苯、己烷、礦物油)、具有基于氧的官能團的烴透明劑(例如醇(例如乙醇)、乙酸鹽、醚、縮醛等)或透明劑的混合物(例如70％至85％二氧戊環，其余部分是另外的一種或多種透明劑)組合。
以下是在分析前處理中包括二氧戊環的組合物用于處理取自身體的組織以進行診斷的示例性用途。
1.使用脫水試劑，如乙醇、甲醇、異丙醇、丙酮等或這些試劑的組合以實現組織的脫水，隨后以獨立試劑的形式或以與諸如乙醇、二甲苯等其它試劑的混合物的形式使用二氧戊環以進行透明化。具體實例包括：
a)使用95％至100％乙醇進行脫水，隨后使用1,3-二氧戊環進行透明化；
b)使用乙醇-異丙醇混合物(70:30v/v)進行脫水，隨后使用1,3-二氧戊環進行透明化；
c)使用丙酮-異丙醇-乙二醇混合物進行脫水，隨后使用1,3-二氧戊環進行透明化；
d)使用70％試劑乙醇(用1％至10％異丙醇和甲醇變性的純乙醇)進行脫水，隨后使用1,3-二氧戊環進行透明化；以及
e)使用含有多達2％乙酸的95％至100％試劑乙醇，隨后使用1,3-二氧戊環進行透明化。
2.使用1,3-二氧戊環-試劑乙醇混合物(例如80:20、85:15、90:10、95:5v/v)進行透明化。
3.使用二氧戊環作為脫水混合物的一部分以實現組織脫水并且再次使用二氧戊環作為單獨的透明化試劑或作為透明化混合物(如上列的那些)的一部分實現透明化。用于脫水的代表性混合物包括試劑乙醇(例如乙醇)-1,3-二氧戊環混合物(70:30；50:50以及30:70v/v)。
4.使用二氧戊環作為石蠟中的添加劑(例如石蠟中多達20％的二氧戊環)以有助于蠟浸潤到組織中。
用于脫水、透明化或浸潤處理的包括二氧戊環的組合物可以在常規的組織處理器上用于一般是幾小時長的常規處理方案或用于更短時間(例如60分鐘或更短)的短方案。包括二氧戊環的組合物還可以在常規的組織處理器上的這樣的處理中用于在高達70℃的試劑處理溫度的高溫下執行的處理方案。舉例來說，用于組織脫水的包括二氧戊環的組合物連同試劑醇以及用于透明化的包括二氧戊環的組合物單獨或作為混合物的一部分可以在無需額外加熱所述處理的操作溫度下或在60℃的升高的試劑溫度下進行。對于浸潤處理，包括二氧戊環的組合物可以與約65℃-70℃溫度的石蠟組合。
用作脫水劑、透明劑或浸潤劑的包括二氧戊環的組合物還適于與微波輔助的組織處理一起用于對于常規尺寸的組織約60分鐘、對于更小的組織(活檢、核心等)更短時間段的一般處理方案。
具體實施方式
實施例
以下代表了在分析前處理中使用包括二氧戊環的組合物的具體實施例。
實施例1
對組織進行取材并且在10％中性緩沖福爾馬林中固定6小時至24小時。然后組織放置在試劑醇(90％-100％)中30分鐘。然后在微波處理下組織在1,3-二氧戊環中放置40分鐘。最后，通過在約65℃的與1,3-二氧戊環(5％v/v)混合的石蠟中放置40分鐘來浸潤組織。
實施例2
對組織進行取材并且在10％中性緩沖福爾馬林中固定6小時至24小時。然后組織在兩個連續的試劑醇(95％-100％)站中各自放置15分鐘(或在一個試劑醇站中放置30分鐘)。然后組織在兩個連續的1,3-二氧戊環站中各自放置15分鐘。最后，通過在兩個連續的石蠟(65℃)站中各自放置15分鐘來浸潤組織。
實施例3
對組織進行取材并且在10％中性緩沖福爾馬林中固定6小時至24小時。然后組織在兩個連續的試劑醇(95％-100％)站中各自放置30分鐘(或在一個試劑醇站中放置30分鐘-60分鐘)。然后組織在兩個連續的1,3-二氧戊環站中各自放置30分鐘。最后，通過在兩個連續的石蠟(65℃)站中各自放置30分鐘來浸潤組織。
實施例4
在這個實施例中，遵循實施例2的處理方案并且通過微波輔助進行1,3-二氧戊環步驟和石蠟步驟來進行處理。
上述實施例主要涉及使用縮醛溶劑(例如二氧戊環)處理生物樣品，其中所述處理是脫水、透明化或浸潤。縮醛溶劑還可以用作固定劑。
1,3-二氧戊環的構筑塊例如是甲醛和乙二醇或環氧乙烷。1,3-二氧戊環或甲縮醛乙二醇是在工業上通過在布朗斯臺德
各種文獻已經引用了由縮醛形成醛的方式。1,3-二氧戊環的水解逆轉縮合反應以在相對溫和的條件下產生甲醛和乙二醇。可以通過將鹽酸添加到1,3-二氧戊環中來進行反應。改變當量濃度(n)和體積可以在反應中產生不同量的甲醛。對于每一摩爾的1,3-二氧戊環，在室溫在約四小時內使用6nhcl例如提供一摩爾的甲醛。
在室溫在30分鐘至八小時的持續時間內在作為催化劑的丙酮和三氟甲烷-磺酸銦(iii)(in(otf)3)存在下，顯示縮醛和縮酮的脫保護。可以通過在100℃使用微波來使反應加速以在5分鐘至15分鐘內完成反應。
在室溫在濕硝基甲烷中使用溫和的路易斯酸催化劑er(otf)3來進行環狀縮醛的化學選擇性裂解。類似地，在濕硝基甲烷中，通過在幾乎中性的ph值下使用催化性三氟甲磺酸鈰(iii)裂解縮醛的化學選擇性方法在1小時至24小時的時間段內提供高產率。
還已經報道了在中性條件下在催化量的碘存在下在數分鐘內以優良的產率進行無環縮醛和環狀縮醛脫保護。
在一個實施方案中，描述了一種系統和方法，其中借助于催化劑、溫度、壓力、添加水、微波以及其組合，在一個或多個組織放入它當中的原位或在添加一個或多個組織之前不久裂解1,3-二氧戊環。1,3-二氧戊環的一部分將經過水解以產生甲醛，所述甲醛有助于所述一個或多個組織的固定，同時所述系統中的1,3-二氧戊環的其余部分可有助于通過使所述一個或多個組織脫水和透明化同時處理所述一個或多個組織。所述處理可以用于已經通過置于各種濃度的試劑醇、乙醇、甲醇、異丙醇、丙酮或類似的脫水劑中以進行脫水的組織，這將提高組織透明化。
代表性地，采集人類組織或動物組織并且放置在裝有1,3-二氧戊環的可密封的容器或反應室中。將水和幾滴鹽酸添加到容器中。在相對溫和的或室內的溫度和壓力條件下進行水解以產生甲醛和乙二醇。反應中獲得的甲醛氣體溶解在水中以制成福爾馬林固定劑。可以在添加緩沖試劑的情況下進行該處理。還可以通過使用路易斯酸、布朗斯臺德酸以及其它市售催化劑來催化反應。
可以對新鮮獲得的、先前冷凍的或先前脫水的組織進行使用諸如1,3-二氧戊環的縮醛的固定。可以通過可在文獻中獲得的不同的方法獲得來自1,3-二氧戊環的甲醛。1,3-二氧戊環的水解反應可以通過不同的質子供體酸催化劑實現，所述催化劑例如鹽酸(hcl)、硫酸(h2so4)、可商購的基于酸的催化劑，如甲苯磺酸催化劑和包括但不限于碘、溴、三氟甲磺酸鈰(iii)以及三氟甲磺酸銦(iii)的路易斯酸。可以通過使用諸如磷酸鹽的緩沖化學品來控制系統的ph值。用于水解反應的酸的濃度的變化會使得甲醛的反應和產生的速率發生變化。可以改變1,3-二氧戊環、去離子(d.i.)水以及催化劑的比率以改變甲醛的反應和產生的速率。可以通過改變反應溫度來使反應速率發生變化和改變。更高的溫度提高反應速率，而更低的溫度降低反應速率。可以使用微波來優化反應速率。
實施例5
使用二氧戊環作為組織固定劑的一個實施例是：
在79.5克1,3-二氧戊環中添加19.5克去離子水。將組織放入1,3-二氧戊環和水的混合物中，組織可以是新鮮獲得的、先前冷凍的或脫水的。將幾滴(例如2滴至4滴)6n鹽酸添加到系統中并且將反應室關閉以避免甲醛氣體逸出。提供混合以獲得均勻的混合物。二氧戊環的酸催化水解反應產生乙二醇和甲醛，所述甲醛預期溶解在未反應的水中。新形成的福爾馬林與組織中的蛋白質反應以實現固定，同時二氧戊環有助于通過去除脂質而使組織透明化。
實施方式
實施方式1是一種方法，所述方法包括用包括縮醛溶劑的組合物處理取自身體的生物樣品。
在實施方式2中，實施方式1的方法的縮醛溶劑包括二氧戊環。
在實施方式3中，實施方式1或2的方法的處理所述生物樣品包括固定所述生物樣品。
在實施方式4中，實施方式3的方法的縮醛溶劑是二氧戊環并且固定所述生物樣品包括使所述生物樣品與包括所述二氧戊環、催化劑以及水的混合物接觸。
在實施方式5中，在用所述組合物處理所述生物樣品之前，實施方式1的方法包括固定所述生物樣品。
在實施方式6中，在固定所述生物樣品后，實施方式5的方法包括使所述生物樣品脫水和透明化并且用所述組合物處理所述生物樣品包括作為至少一次脫水和透明化的至少一部分進行處理。
在實施方式7中，在用所述組合物處理所述生物樣品之前，實施方式6的方法包括使所述固定的生物樣品脫水。
在實施方式8中，實施方式7的方法的脫水包括用包括醇的脫水組合物處理所述固定的生物樣品。
在實施方式9中，實施方式7的方法的脫水組合物包括丙酮和乙二醇中的至少一種。
在實施方式10中，實施方式6的方法的脫水包括用包括所述組合物的脫水組合物處理所述固定的生物樣品。
在實施方式11中，在固定所述生物樣品后，實施方式5的方法包括使所述生物樣品脫水、透明化以及浸潤所述生物樣品，并且用所述組合物處理所述生物樣品包括作為浸潤所述生物樣品的至少一部分進行處理。
在實施方式12中，實施方式11的方法的組合物進一步包括石蠟。
在實施方式13中，實施方式2或3的方法的二氧戊環包括1,3-二氧戊環。
實施方式14是一種方法，所述方法包括使取自身體的組織與包括縮醛溶劑的組合物接觸作為固定、脫水、透明化以及浸潤處理中的至少一個。
在實施方式15中，實施方式1至14中任一方法的生物樣品包括組織。
在實施方式16中，實施方式14的方法的縮醛溶劑包括二氧戊環。
在實施方式17中，實施方式14至16中任一方法的處理是固定處理。
在實施方式18中，實施方式16的方法的二氧戊環包括1,3-二氧戊環。
在實施方式19中，實施方式14的方法的處理是透明化處理。
在實施方式20中，實施方式19的方法進一步包括使所述生物樣品與另一種透明劑接觸。
在實施方式21中，實施方式20的方法的另一種透明劑包括烴透明劑以及具有基于氧的官能團的烴透明劑中的至少一種。
在實施方式22中，實施方式20的方法的二氧戊環和另一種透明劑包括混合物。
在實施方式23中，實施方式12至14中任一方法的處理是脫水處理。
在實施方式24中，實施方式20的方法進一步包括使所述組織與醇接觸。
在實施方式25中，實施方式24的方法的縮醛溶劑和醇包括混合物。
在實施方式26中，實施方式14的方法的處理是浸潤處理。
在實施方式27中，實施方式26的方法進一步包括使所述生物樣品與石蠟接觸。
在實施方式28中，實施方式27的方法的二氧戊環和石蠟包括混合物。
在實施方式29中，固定的生物樣品如組織樣品是由實施方式1至28中任一方法制備的。
在上述說明中，為了解釋的目的，已經闡述了許多具體細節以提供對實施方案的透徹理解。然而，對于本領域技術人員來說將顯而易見的是，可以在不存在這些具體細節中的一些的情況下實施一個或多個其它實施方案。所述的具體實施方案不是為了限制本發明，而是為了說明本發明而提供。本發明的范圍不應當由上文所提供的具體實施例來確定，而僅由以下權利要求書來確定。在其它情況下，公知的結構、裝置、以及操作已經以框圖形式示出或沒有詳細示出以避免使對說明的理解模糊不清。在認為適當的情況下，附圖標記或附圖標記的末端部分已經在附圖之間重復以指示相應的或類似的要素，這些要素可以任選地具有類似的特征。
還應當了解的是，在整個本說明書中提到例如“一個實施方案”、“實施方案”、“一個或多個實施方案”、或“不同的實施方案”時，意指在實施本發明中可以包括特定的特征。類似地，應當了解的是，在說明書中，為了簡化本公開以及有助于理解本發明的各個方面，各種特征有時在單個實施方案、附圖或其說明中被歸成一組。然而，本公開的方法不應當被解釋為體現這樣的發明：該發明需要比每個權利要求中明確敘述的特征更多的特征的意圖。相反，如以下權利要求書所反映，本發明的方面可以在于少于單個公開的實施方案的所有特征。因此，具體實施方式之后的權利要求書在此被明確地并入該具體實施方式中，每個權利要求自身獨立作為本發明的一個單獨的實施方案。