氨基酸調控量子點熒光陣列傳感器對金屬離子的檢測方法與流程

本發明屬于光學分析領域，具體涉及一種基于量子點的熒光分析方法。

背景技術：

目前常用的金屬離子檢測分析方法主要包括：原子發射法、原子吸收法、電感耦合等離子體法等等。這些方法都存在一些弊端，對操作技能有比較高的要求，儀器也比較貴重，成本較高，同時操作繁瑣，且無法對多價態金屬離子進行區分，同時對操作人員的專業技術要求比較高，也比較耗時。

量子點(Quantum dots，QDs)是一種由Ⅱ-Ⅵ族或Ⅲ-Ⅴ族元素組成的直徑在1-10nm的球狀晶體，與傳統的有機熒光染料或鑭系配合物相比，熒光量子點具有以下光學特性：(1)量子點的發射波長可通過控制它的粒徑大小來“調諧”，因而可獲得多種可分辨的顏色。(2)不同大小的納米晶體能被同一波長的光激發并發出不同顏色的光，其激發光譜寬且連續分布，而發射光譜呈對稱分布且寬度窄，因此不同的量子點可以由同一波長的光激發，并允許同時使用不同光譜的量子點來進行生物標記。(3)量子點具有良好的光化學穩定性，可以耐受更強的激發光和更長的光發射周期。因此量子點對生物體內各種蛋白質或者細胞的相互作用監控更為有效，在生物學中有著廣泛的應用。

基于量子點的熒光傳感器在生物學中的成功應用，也給予研究者以啟示，用量子點、或小分子有機物修飾的量子點檢測微量金屬離子是極有價值的研究方向。

技術實現要素：

針對本技術領域存在的不足之處，本發明的目的是提供多種氨基酸調節拓展量子點的熒光陣列傳感器，以高效快速的檢測金屬離子的方法。

實現本發明上述目的技術方案為：

氨基酸調控量子點熒光陣列傳感器對金屬離子的檢測方法，用穩定劑修飾Mn摻雜ZnS的量子點，與氨基酸結合，加入待測的金屬離子溶液，進行熒光檢測；

其中，所述氨基酸為谷氨酰胺、精氨酸兩種。

其中，所述用穩定劑修飾，為用硫代甘油包覆，或用巰基丙酸封端。

本發明所述的檢測方法中，量子點的制備可采用已有的方法。提供一種優選的量子點制備方法：所述Mn摻雜ZnS的量子點采用成核摻雜法用水相合成法合成：ZnSO₄和Mn(CH₃COO)₂混合的溶液在室溫下攪拌，提供摻雜量子點的Mn²⁺；調節pH值至10.0～10.5，

在氣體保護條件下，并用N₂鼓泡30分鐘。

將Na₂S快速加入混合溶液中，將混合物回流反應。

其中，按S、Zn的摩爾計，加入的Na₂S與ZnSO₄的比例可以為0.7～1.1：1。

其中，可采用氫氧化鈉或碳酸鈉的水溶液調節pH值，其水溶液的濃度可以是0.1M～10M。

其中，按Mn、Zn的摩爾計，ZnSO₄和Mn(CH₃COO)₂混合的溶液中Mn：Zn為0.1～5：5；所述回流反應的時間為15～25小時；

回流反應后冷卻至室溫，通過加入乙醇和離心從水溶液中分離產物，用乙醇洗滌并在室溫下真空干燥。

為了獲得穩定劑修飾量子點，本發明的一種優選技術方案為：ZnSO₄和Mn(CH₃COO)₂混合后，再與硫代甘油混合，按摩爾比加入的硫代甘油與ZnSO₄的比例為2～8：1。

本發明的另一優選技術方案為：ZnSO₄和Mn(CH₃COO)₂混合的溶液中加入巰基丙酸(MPA)，然后調節pH值；按Zn的摩爾計，每mmol鋅加入0.2～0.4mL的巰基丙酸。

所述的檢測方法，是將穩定劑修飾Mn摻雜ZnS的量子點、氨基酸混合，加入待測的金屬離子溶液，量子點、氨基酸、金屬離子混合溶液中穩定劑修飾Mn摻雜ZnS的量子點的含量為50～200μg/mL。

其中，所述金屬離子為Ni²⁺，Co²⁺，Mn²⁺，Cu²⁺，Ag⁺，Cd²⁺，Fe²⁺，Fe³⁺中的一種或多種。

其中，進行熒光檢測的溶液中，金屬離子的濃度為0.5～20μmol/L。

更優選地，本發明檢測方法中，將穩定劑修飾Mn摻雜ZnS的量子點配成100～500μg/mL的溶液，按照體積比1～3：1加入氨基酸溶液，所述氨基酸溶液的濃度為0.1～1mmol/L。

本發明的有益效果在于：

1.本發明提出的方法，巧妙地將QDs和氨基酸結合在一起，在僅使用兩種不同配體包袱的QDs的情況下，可以檢測多種金屬離子，如果量子點種類增加(例如10種)，氨基酸的種類也增加(例如18種)，就可以容易獲得增加的傳感單元數量(10x18＝180種)，以便達到更多種類金屬離子的高靈敏度檢測和識別；

2.檢出限低，在500nM的情況下，可以百分百區分9種金屬離子；

3.可以做到百分百的區分不同價態的同種金屬離子，本實驗中可以在5μM濃度下，百分百區分Fe²⁺和Fe³⁺；

4.我們在通過加入氨基酸之后，發現對大部分金屬離子的響應信號，或是靈敏度，都得到了大大的提高，這一點我們可以在對鈷離子的定量的指紋圖譜中明顯看出來，同時在九種金屬離子中Fe²⁺，Ni²⁺，Co²⁺，Mn²⁺，在濃度為0.5～20μmol/L的范圍內，有良好的線性，線性方程和R²值分別是y＝-36.34x+19.61(R²＝0.9963)，y＝44.43x-23.98(R²＝0.9963)，y＝-59.11x+31.91(R²＝0.9819)，y＝-31.93x+17.24(R²＝0.9828)。這說明本實驗不僅可以對金屬離子進行定性分析，同時也對一些金屬離子進行定量分析，也擁有良好的線性。

5.Mn摻雜ZnS的QDs，無毒，易制備，具有價格低，穩定，壽命長，產率高，熒光性好，操作方便等特點。

通過選擇一系列非選擇性或半選擇性的傳感單元構建陣列傳感器，對材料的特異性要求大大降低，檢測對象的范圍也有了極大的拓展，這使得陣列傳感器在復雜樣品檢測方面表現出極大的優勢。

附圖說明

圖1為本發明氨基酸調節量子點熒光陣列傳感器對金屬離子的檢測方法的原理圖；圖1之左圖為流程圖，圖1之右下圖為陣列結構圖，圖1之右上圖為九種金屬離子檢測的結果的指紋圖譜。

圖2為實施例6對九種金屬離子檢測結果的三維LDA分析圖。

圖3為實施例5和實施例6對九種金屬離子0.5μM水溶液檢測的結果的指紋圖譜。

圖4為對九種金屬離子檢測結果的歐氏距離(euclidean distance)分析圖。

具體實施方式

下面通過最佳實施例來說明本發明。本領域技術人員所應知的是，實施例只用來說明本發明而不是用來限制本發明的范圍。

實施例中，如無特別說明，所用手段均為本領域常規的手段。

實施例1：巰基丙酸封端Mn摻雜ZnS量子點的制備

制備基于3-巰基丙酸封端的Mn-ZnS量子點(MPA-QD)：將ZnSO₄·7H₂O(7.5mL，0.1M)，Mn(CH₃COO)₂·4H₂O(0.1mL，0.1M)和巰基丙酸MPA(0.26mL)加入到三頸燒瓶中。用超純水將混合溶液量補充至50mL，并用10M NaOH調節至pH 10.3-10.5。

在室溫下通過氬氣鼓泡除去空氣30分鐘后，將Na₂S·9H₂O(7.5mL，0.1M)快速注入溶液中。將混合物劇烈攪拌20分鐘，然后在50℃下再攪拌2小時以形成MPA-QDs。為了純化，將獲得的QDs用乙醇沉淀，通過離心(8000rpm，5分鐘)分離。將該乙醇沉淀-離心分離過程重復三次。最后，將制備好的MPA-QDs在真空中干燥。

實施例2

用硫代甘油包覆Mn摻雜ZnS的量子點的操作為：

1.0M ZnSO₄·7H₂O(5.0mL)，0.1M Mn(CH₃COO)₂·4H₂O(1.5mL)的溶液在室溫下攪拌，獲得Mn²⁺摻雜的量子點；再與1.0M硫代甘油(TG，20mL)混合，加入到三頸燒瓶中。用超純水將混合溶液量補充至50mL，用10M NaOH調節至pH 10.3并用N₂鼓泡30分鐘。

然后將Na₂S·9H₂O水溶液(1.0M，4.5mL)快速注入反應燒瓶中，將混合物回流20小時。冷卻至室溫后，通過加入乙醇和通過離心從水溶液中分離，操作同實施例1。用乙醇洗滌并在室溫下真空干燥。

實施例3

將實施例2制好的由硫代甘油(TG)包覆的Mn摻雜ZnS的QDs配成200μg/mL的溶液，用槍頭取出210μL加入到離心管中，再加入配好的800μM的Arg溶液105μL，再加入63μL的超純水，最后加入42μL的10μM的金屬離子溶液，在搖床上搖勻之后用槍頭取出200μL的溶液加入到比色皿中，使用愛丁堡FLS-920瞬態穩態熒光光譜儀進行熒光檢測，透過光強度記為I(參見圖1之S5)。

在沒有加入金屬離子溶液時檢測空白溶液的透過光強度I₀。記錄熒光光譜數據，再用數據處理軟件(originlab)進行處理，如圖2，利用QDs和氨基酸，構建出六個陣列單元，加入多種金屬離子，可以通過不同的響應信號高效快速的識別金屬離子。

本實施例對Ni²⁺，Co²⁺，Mn²⁺，Cu²⁺，Ag⁺，Cd²⁺，Fe²⁺，Fe³⁺，九種金屬離子分別進行檢測，每種金屬離子測六個平行樣，得出指紋圖譜(圖1之右上圖)。

實施例4

將實施例1制好的由巰基丙酸封端的Mn摻雜ZnS的QDs配成200μg/mL的溶液，用槍頭取出210μL加入到離心管中，再加入800μM的Arg溶液105μL，再加入63μL的超純水，最后加入42μL的10μM的金屬離子溶液，在搖床上搖勻之后用槍頭取出200μL的溶液加入到比色皿中，使用愛丁堡FLS-920瞬態穩態熒光光譜儀進行熒光檢測，透過光強度記為I(參見圖1之S6)。

在沒有加入金屬離子溶液時檢測空白溶液的透過光強度I₀。記錄熒光光譜數據，再用軟件進行處理。所得指紋圖見圖1之“MPA-QDs+Arg”。

對比例1

將實施例2制好的由硫代甘油(TG)包覆的Mn摻雜ZnS的QDs配成200μg/mL的溶液，用槍頭取出210μL加入到離心管中，再加入168μL的超純水，最后加入42μL的10μM的金屬離子溶液，在搖床上搖勻之后用槍頭取出200μL的溶液加入到比色皿中，使用愛丁堡FLS-920瞬態穩態熒光光譜儀進行熒光檢測，透過光強度記為I(參見圖1之S3)。

在沒有加入金屬離子溶液時檢測空白溶液的透過光強度I₀。記錄熒光光譜數據，再用軟件進行處理。

本實施例對Ni²⁺，Co²⁺，Ca²⁺，Mn²⁺，Cu²⁺，Ag⁺，Cd²⁺，Fe²⁺，Fe³⁺九種金屬離子分別進行檢測，結果見圖1之“TG-QDs”。

對比例2

將實施例1制好的巰基丙酸封端Mn摻雜ZnS的QDs配成200μg/mL的溶液，用槍頭取出210μL加入到離心管中，再加入168μL的超純水，最后加入42μL的10μM的金屬離子溶液，在搖床上搖勻之后用槍頭取出200μL的溶液加入到比色皿中，使用愛丁堡FLS-920瞬態穩態熒光光譜儀進行熒光檢測，透過光強度記為I(參見圖1之S4)。

在沒有加入金屬離子溶液時檢測空白溶液的透過光強度I₀。記錄熒光光譜數據，再用軟件進行處理。結果見圖1之“MPA-QDs”。

由指紋圖(原圖為彩色)的比較可以看出，Arg修飾的硫代甘油包覆量子點的檢測靈敏度最高，可以清楚地區分九種不同的金屬離子，對Arg修飾的硫代甘油包覆量子點對0.5μM的九種金屬離子檢測的結果進行線性判別分析(LDA)，可以看出，不同種金屬離子數據點之間沒有交叉或覆蓋，可百分之百地區分九種離子。

兩種量子點在沒有加入氨基酸時，對這九種金屬離子在500nM不能很好區分，而在兩種氨基酸的調控下，它們對這些金屬離子的區分能力大大提高，最后能達到很好的區分和檢測能力。

實施例5

將實施例2制好的由硫代甘油(TG)包覆的Mn摻雜ZnS的QDs配成200μg/mL的溶液，用槍頭取出210μL加入到離心管中，再加入配好的800μM的谷氨酰胺(Gln)溶液105μL，再加入63μL的超純水，最后加入42μL的5μM的金屬離子溶液，在搖床上搖勻之后用槍頭取出200μL的溶液加入到比色皿中，使用愛丁堡FLS-920瞬態穩態熒光光譜儀進行熒光檢測，記錄熒光光譜數據，再用軟件進行處理。

改變檢測樣品金屬離子的濃度，檢測0.5～20μmol/L范圍內的離子含量，結果表明九種金屬離子中的Fe²⁺，Ni²⁺，Co²⁺，Mn²⁺，在濃度為0.5～20μmol/L的范圍內，有良好的線性，線性方程和R²值分別是y＝-36.34x+19.61(R²＝0.9963)，y＝44.43x-23.98(R²＝0.9963)，y＝-59.11x+31.91(R²＝0.9819)，y＝-31.93x+17.24(R²＝0.9828)。

實施例6

將實施例2制好的由硫代甘油(TG)包覆的Mn摻雜ZnS的QDs配成200μg/mL的溶液，用槍頭取出210μL加入到離心管中，再加入配好的800μM的Arg溶液105μL，再加入63μL的超純水，最后加入42μL的5μM的金屬離子溶液，在搖床上搖勻之后用槍頭取出200μL的溶液加入到比色皿中，使用愛丁堡FLS-920瞬態穩態熒光光譜儀進行熒光檢測，透過光強度記為I。

在沒有加入金屬離子溶液時檢測空白溶液的透過光強度I₀。記錄熒光光譜數據，再用數據處理軟件(Originlab)進行處理。利用QDs和氨基酸，構建出陣列單元，加入多種金屬離子，可以通過不同的響應信號高效快速的識別金屬離子。

本實施例對實施例3同樣的九種金屬離子分別進行檢測，每種金屬離子測六個平行樣，圖2為S1-S6對0.5μM的九種金屬離子檢測結果的三維線性判別分析(LDA)圖，原圖為彩色，每種金屬離子做六個平行樣，其結果用同一種顏色標識，由圖2可以看出，不同種金屬離子數據點之間沒有交叉或覆蓋，可百分之百地區分九種離子。實施例5和實施例6檢測0.5μM得到的指紋圖見圖3，歐氏距離分析見圖4，分析結果表明，在500nM的情況下，可以百分百區分Ni²⁺，Co²⁺，Ca²⁺，Mn²⁺，Cu²⁺，Ag⁺，Cd²⁺，Fe²⁺，Fe³⁺九種金屬離子。

以上的實施例僅僅是對本發明的優選實施方式進行描述，并非對本發明的范圍進行限定，在不脫離本發明設計精神的前提下，本領域普通工程技術人員對本發明的技術方案做出的各種變型和改進，均應落入本發明的權利要求書確定的保護范圍內。