一種快速檢測阪崎克羅諾桿菌的試劑盒及其應用的制作方法

本發明涉及一種快速檢測阪崎克羅諾桿菌的試劑盒及其應用，屬于微生物檢測技術領域。

背景技術：

阪崎克羅諾桿菌屬克羅諾桿菌屬，是一種重要的食源性致病菌，能夠引起嚴重的新生兒腦膜炎、壞死性小腸結腸炎和菌血病等。盡管由阪崎克羅諾桿菌引發的發病率非常低，但它的致死率可達80％，并且幸存的患者經常會留下嚴重的神經系統損傷后遺癥以及發育障礙。在多起阪崎克羅諾引起的疾病事件中調查發現，阪崎克羅諾感染與嬰幼兒配方奶粉存在密切的關系。因此建立一種快速高效檢測乳粉中阪崎克羅諾桿菌的方法尤為重要。

目前常用的傳統分離檢測方法，需要經過前增菌、選擇性培養、生理生化鑒定等，需5-7天才能確定目標菌種，耗時長、勞動量大。因此需要發展一種簡單快速、靈敏特異的方法來進行致病菌的檢測，迅速發展起來的pcr、lamp、elsa、生物傳感器、電化學等檢測方法，雖然具有較好的靈敏度和特異性，但是要求具有專業技能、程序繁瑣、還需要利用昂貴的實驗儀器，而且無法實現現場檢測。

近年來快速發展的膠體金免疫層析試紙條操作簡便、檢測快速、結果可直接肉眼判讀、不需大型儀器、便于攜帶，可用于現場檢測，已成為基層篩選的有效工具。然而由于傳統的膠體金試紙條存在靈敏度低的問題，導致其廣泛應用受到了限制。現在提高膠體金試紙條靈敏度的方法多采用金增強、銀增強等，檢測完成后需引入額外的檢測程序，且用到的還原劑鹽酸羥胺、對苯二酚屬有毒試劑；使用雙重膠體金進行信號放大相對簡便，但是目前常用的兩者結合方式有生物素/鏈酶親和素方大，需要在同一膠體金上標記兩種物質，標記方式復雜，且存在不確定因素，影響檢測的穩定性；dna分子雜交的方式，耗時長，易造成自組裝折疊，而且多采用將兩種金標抗體直接分別噴在兩個結合墊上的方式，使得兩種膠體金不能夠很好地結合形成穩定的結合體。因此迫切需要提供一種簡便有效提高傳統試紙條檢測靈敏度的方法，實現簡便、快速檢測阪崎克羅諾桿菌。

技術實現要素：

為解決現有傳統試紙條靈敏度低，現有的提高靈敏度的方式標記方式復雜、穩定性差、需要引入有毒試劑安全性低、耗時長的問題，本發明提供了一種快速檢測阪崎克羅諾桿菌的試劑盒及應用，采用的技術方案如下：

本發明的目的在于提供一種快速檢測阪崎克羅諾桿菌的試劑盒，所述試劑盒包括酶標孔a、信號增強型試紙條b、第一金標抗體c和第二金標抗體d；所述信號增強型試紙條b包括樣品墊1、結合墊2、nc膜3、吸水墊4和底板5，所述nc膜3上設有檢測線6和控制線7，所述檢測線6上包被有抗阪崎克羅諾桿菌捕獲抗體，所述控制線7上包被有羊抗鼠二抗；所述第一金標抗體c上包被有抗阪崎克羅諾桿菌檢測抗體，且由bsa封閉結合位點；所述第二金標抗體d上包被有抗bsa抗體；所述第一金標抗體c和第二金標抗體d結合形成雙金標抗體，結構原理圖如圖1所示。

優選地，所述第一金標抗體(c)和第二金標抗體(d)的體積均為6ul-9ul，第一金標抗體(c)和第二金標抗體(d)按照體積比為1：1結合形成雙金標抗體。

更優選地，所述第一金標抗體c和第二金標抗體d是按照8ul第一金標抗體c與8ul第二金標抗體d結合形成雙金標抗體。

優選地，所述第一金標抗體c中膠體金粒徑為26nm-42nm；所述第二金標抗體d中膠體金粒徑為26nm-54nm。

更優選地，所述第一金標抗體c中膠體金粒徑為26nm；所述第二金標抗體d中膠體金粒徑為42nm。

優選地，本發明所述第一金標抗體c的制備方法為：每1ml膠體金溶液加入碳酸鉀調節溶液ph值后加入抗阪崎克羅諾單克隆檢測抗體8ug，混勻，室溫靜置反應1h以上后，加入封閉劑10％bsa100ul，混勻，室溫靜置反應1h以上；離心后去掉上清，加150ul復溶液復溶沉淀并混勻即得第一金標抗體。

優選地，本發明所述第二金標抗體d的制備方法為：每1ml膠體金溶液加入碳酸鉀調節溶液ph值后加入抗bsa抗體8ug，混勻，室溫靜置反應1h以上后，加入封閉劑10％100ul的人血清白蛋白，混勻，室溫靜置反應1h以上；離心后去掉上清，加150ul復溶液復溶沉淀并混勻即得第二金標抗體。

優選地，所述檢測線6上包被的抗阪崎克羅諾桿菌捕獲抗體的濃度為1.8mg/ml；所述控制線7上包被的羊抗鼠二抗的濃度為0.6mg/ml。

本發明所述試劑盒的檢測方法包括如下步驟：

1)在酶標孔a中加入100ul樣品液和8ul第一金標抗體c，室溫下孵育4min；

2)再加入8ul第二金標抗體d，混勻；

3)將試紙條插入酶標孔a中進行檢測，10min后觀察檢測結果；

4)判定方法：若信號增強型試紙條b的檢測線(6)、控制線(7)都出現紅色條帶，表明樣品中含有阪崎克羅諾桿菌，陽性結果；若檢測線(6)未出現紅色條帶，控制線(7)出現紅色條帶，表明樣品中不含有阪崎克羅諾桿菌，陰性結果；若控制線(7)未出現紅色條帶，表明試紙條失效；其中檢測線6顏色越深，表明樣品中含有的阪崎克羅諾桿菌濃度越高。

本發明還提供了一種所述的試劑盒在檢測阪崎克羅諾桿菌中的應用。

本發明的一種具體實施方式，一種利用所述的試劑盒檢測乳粉中阪崎克羅諾桿菌的方法，包括以下步驟：

1)100g奶粉和900ml預熱的nb培養基混合后，前增菌5h，取10ml離心后，去除干凈上清及奶皮，將沉淀用1ml生理鹽水復溶；

2)取步驟1)所得樣品溶液100ul及第一金標抗體c8ul于酶標孔a中孵育4min后加入第二金標抗體d8ul，混勻；

3)將信號增強型試紙條b插入步驟2中的酶標孔a中，10min后觀察檢測結果；

4)判定方法：若信號增強型試紙條b的檢測線(6)出現紅色條帶，控制線(7)出現紅色條帶，表明乳樣中含有阪崎克羅諾桿菌，陽性結果；若檢測線(6)未出現紅色條帶，控制線(7)出現紅色條帶，表明乳樣中未含有阪崎克羅諾桿菌，陰性結果；若控制線(7)未出現紅色條帶，表明試紙條失效；其中檢測線6顏色越深，表明乳樣中含有的阪崎克羅諾桿菌濃度越高。

優選地，所述復溶液的配方組成如下：5％蔗糖、12％海藻糖、1％bsa和0.3％吐溫-20,且ph值為8.5的tris緩沖溶液。

本發明所述信號增強型試紙條b的組裝方法為：樣品墊及結合墊先經過稀釋液處理，后置于65℃鼓風干燥箱中干燥1h取出備用。將樣品墊、結合墊、nc膜、吸收墊分別黏貼在pvc板上，每兩個墊之間有2mm-3mm的交疊，在nc膜上分別噴抗阪崎克羅諾捕獲抗體、羊抗鼠二抗分別作為檢測線6和控制線7，控制劃膜儀的噴速為0.8ul/cm，后置于37℃鼓風干燥箱中干燥1h取出，切成3mm寬的試紙條，裝入鋁箔袋中，加干燥劑密封，置于干燥缸中保存備用

優選地，所述稀釋液的配方組成如下：2％吐溫-20、0.1％氯化鈉、1％聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、0.5％酪蛋白，且ph值為8.5的tris緩沖溶液。

優選地，檢測線濃度為1.8mg/ml、控制線濃度為0.6mg/ml。

本發明采用了試紙條雙抗夾心的原理進行檢測大分子物質阪崎克羅諾桿菌。

本發明試劑盒利用抗bsa抗體為連接體制備雙膠體金，來增強顯色信號，提高檢測靈敏度，并借助酶標孔進行兩種金標抗體及樣品的預孵育，使得金標抗體與樣品以及兩種金標抗體充分結合作用，并省去了制作金標墊的過程，提高了試紙條的檢測性能。

本發明有益效果：

1、本發明提供了一種檢測阪崎克羅諾桿菌的試劑盒，發明一種新型的試劑盒，其中包括信號增強型試紙條，然后結合樣品預孵育過程，即先在酶標孔中加入兩種金標抗體和樣品液，后上條檢測。相比于傳統試紙條將金標抗體噴涂在結合墊上，此種方式省去了將金標抗體噴涂在結合墊上及干燥的過程，使得試紙條的制作過程更加簡單；傳統的方法樣品和金標抗體是瞬時反應，沒有充分的時間使兩者結合，通過預孵育方法可控制樣品與金標抗體結合的時間，使得兩者可以完全相互作用，增加了樣品與金標抗體的結合量，同時，預孵育過程使得兩種金標抗體可以有效結合形成穩定的混合體，從而提高了試紙條的檢測檢測靈敏度和穩定性，產生了預料不到的技術效果。

2、現有技術中利用生物素/鏈霉親和素標記在同一種膠體金的標記方式復雜，且存在不確定因素，影響檢測的穩定性，以及dna分子雜交的方式耗時長，易造成自組裝折疊，相比于上述兩種方式，本發明通過兩種金標抗體，利用抗bsa抗體為連接體連接兩種金標抗體進而獲得雙重膠體金，能夠克服上述問題，該標記方式簡單，易制備，檢測的穩定性好，時間短，極大降低自組裝折疊現象的產生。

3、該試劑盒結合雙重膠體金以及預孵育進行檢測乳粉中阪崎克羅諾桿菌，增強了試紙條的檢測線處的顯色效果，提高了檢測的靈敏度，解決了試紙條靈敏低的問題，本發明試劑盒對純阪崎克羅諾桿菌的檢測限可達10³cfu/ml，對奶粉的檢測限可達10⁴cfu/ml，傳統型試紙條對純阪崎克羅諾桿菌的檢測限為10⁵cfu/ml，對奶粉的檢測限為10⁶cfu/ml，本發明試劑盒相比于傳統型試紙條靈敏度提高了100倍，降低了檢測限；同時本發明試劑盒所需前增菌時間僅為5h，相比較傳統型前增菌需7h，此種方法使檢測時間縮短了2h。

4、本發明提供了一種簡單方便的提高靈敏度的方式，無需額外的繁瑣操作步驟。所獲得的信號增強型試紙條穩定性好，特異性強，檢測時間短，制作簡便且成本低，方便攜帶，可用于現場檢測。

附圖說明

圖1為試劑盒組成及原理圖；

(a，酶標孔；1，樣品墊；2，結合墊；3，nc膜；4，吸水墊；5，底板；6，檢測線；7，控制線，c，第一金標抗體；d，第二金標抗體)。

圖2為試劑盒檢測阪崎克羅諾桿菌靈敏度結果圖。

圖3為試劑盒檢測乳粉中阪崎克羅諾桿菌靈敏度結果圖。

圖4為傳統試紙條檢測靈乳粉中阪崎克羅諾桿菌靈敏度結果圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明做進一步說明，但本發明不受實施例的限制。

以下實施例中使用的菌株名稱及來源如表1所示。

表1所使用的菌株名稱及來源

實施案例1：試劑盒制備條件優化

1、兩種金標抗體的膠體金粒徑優化

1.1兩種金標抗體的制備

第一金標抗體c的制備即膠體金上標記抗阪崎克羅諾單克隆檢測抗體：取1ml4中不同粒徑(16nm,26nm,42nm,54nm)的膠體金溶液，分別加入0.2m碳酸鉀4ul調節溶液ph值，加入抗阪崎克羅諾單克隆檢測抗體8ug，混勻，室溫靜置反應1h以上后，加入封閉劑10％bsa100ul，混勻，室溫靜置反應1h以上；16nm膠體金溶液10℃，12000rpm，離心20min，去掉上清(上清一定要盡量吸取干凈)；26nm膠體金溶液10℃，7000rpm，離心20min，去掉上清；42nm膠體金溶液10℃，6500rpm，離心20min，去掉上清；54nm膠體金溶液10℃，5200rpm，離心20min，去掉上清；加150ul復溶液(5％蔗糖、12％海藻糖、1％bsa和0.3％吐溫-20,且ph值為8.5的tris緩沖溶液)復溶沉淀并混勻。

第二金標抗體d的制備即膠體金上標記抗阪崎克羅諾單克隆檢測抗體：取1ml4中不同粒徑(16nm,26nm,42nm,54nm)的膠體金溶液，分別加入0.2m碳酸鉀4ul調節溶液ph值，加入抗阪崎克羅諾單克隆檢測抗體8ug，混勻，室溫靜置反應1h以上后，加入封閉劑10％人血清白蛋白100ul，混勻，室溫靜置反應1h以上；16nm膠體金溶液10℃，12000rpm，離心20min，去掉上清(上清一定要盡量吸取干凈)；26nm膠體金溶液10℃，7000rpm，離心20min，去掉上清；42nm膠體金溶液10℃，6500rpm，離心20min，去掉上清；54nm膠體金溶液10℃，5200rpm，離心20min，去掉上清；加150ul復溶液(5％蔗糖、12％海藻糖、1％bsa和0.3％吐溫-20,且ph值為8.5的tris緩沖溶液)復溶沉淀并混勻。

1.2組裝信號增強型試紙條

樣品墊1及結合墊2先經過稀釋液(2％吐溫-20、0.1％氯化鈉、1％聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、0.5％酪蛋白，且ph值為8.5的tris緩沖溶液)處理，后置于65℃鼓風干燥箱中干燥1h取出備用。將結合墊2、nc膜3、吸水墊4分別黏貼在pvc板上，每兩個墊之間有2-3mm的交疊，在nc(3)膜上分別噴抗阪崎克羅諾捕獲抗體1.8mg/ml、羊抗鼠二抗0.6mg/ml分別作為檢測線6和控制線7，控制劃膜儀的噴速為0.8ul/cm，后置于37℃鼓風干燥箱中干燥1h取出，切成3mm寬的試紙條，裝入鋁箔袋中，加干燥劑密封，置于干燥缸中保存備用。

1.3奶粉樣品處理

100g奶粉和900ml預熱的nb培養基混合后，接種1ml10³cfu/ml的阪崎克羅諾桿菌，在37℃，200r/min條件下震蕩培養1-8h，將菌液濃度調整為10³cfu/ml，10⁴cfu/ml，10⁵cfu/ml，10⁶cfu/ml。分別取上述6種濃度的染菌乳樣10ml于4℃、12000r/min條件下離心10min后,盡量去除干凈上清及奶皮，以降低奶粉中蛋白質基質的干擾，將沉淀用1ml生理鹽水復溶。

1.4樣品預孵育

1)在酶標抗中分別加入100ul步驟4中所獲得6種濃度染菌樣品液和8ul第一金標抗體，室溫下孵育4min。

2)再加入8ul第二金標抗體，混勻。

1.5樣品上條檢測

將試紙條插入酶標孔中進行檢測，10min后觀察檢測結果。若信號增強型試紙條b的檢測線6、控制線7都出現紅色條帶，表明可檢出此濃度的阪崎克羅諾桿菌，陽性結果；若檢測線6未出現紅色條帶，控制線7出現紅色條帶，不可檢出此濃度的阪崎克羅諾桿菌，陰性結果；若控制線7未出現紅色條帶，表明試紙條失效。

1.6檢測結果

進行兩種粒徑大小的雙因素交叉實驗，根據表2中數據可以知第一金標抗體的粒徑在26nm-42nm范圍內時，第二金標抗體的粒徑在26nm-54nm范圍內時，檢測限較低，檢測效果較好，其中當第一金標抗體粒徑為26nm，第二金標抗體粒徑為42nm時靈敏度提高效果最好，可檢測到10⁴cfu/ml,且檢測線顏色較深，可明顯觀察到結果，且無假陽性存在。

表2兩種金標抗體粒徑優化結果

注：“－”陰性，“+”和“±”表示t線顯色的強度，“±”比“+”顯色弱，越多“+”表示顯色越強。

2、兩種金標抗體的加入量優化

2.1兩種金標抗體的制備

第一金標抗體c的制備即膠體金上標記抗阪崎克羅諾單克隆檢測抗體：取1ml26nm的膠體金溶液，加入0.2m碳酸鉀4ul調節溶液ph值，加入抗阪崎克羅諾單克隆檢測抗體8ug，混勻，室溫靜置反應1h以上后，加入封閉劑10％bsa100ul，混勻，室溫靜置反應1h以上；后在10℃，7000rpm條件下，離心20min，去掉上清。加150ul復溶液(5％蔗糖、12％海藻糖、1％bsa和0.3％吐溫-20,且ph值為8.5的tris緩沖溶液)復溶沉淀并混勻。

第二金標抗體d的制備即膠體金上標記抗阪崎克羅諾單克隆檢測抗體：取1ml42nm的膠體金溶液，加入0.2m碳酸鉀4ul調節溶液ph值，加入抗阪崎克羅諾單克隆檢測抗體8ug，混勻，室溫靜置反應1h以上后，加入封閉劑10％人血清白蛋白100ul，混勻，室溫靜置反應1h以上；后在10℃，6500rpm條件下，離心20min，去掉上清。加150ul復溶液(5％蔗糖、12％海藻糖、1％bsa和0.3％吐溫-20,且ph值為8.5的tris緩沖溶液)復溶沉淀并混勻。

2.2組裝信號增強型試紙條

樣品墊1及結合墊2先經過稀釋液(2％吐溫-20、0.1％氯化鈉、1％聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、0.5％酪蛋白，且ph值為8.5的tris緩沖溶液)處理，后置于65℃鼓風干燥箱中干燥1h取出備用。將結合墊2、nc膜3、吸水墊4分別黏貼在pvc板上，每兩個墊之間有2-3mm的交疊，在nc(3)膜上分別噴抗阪崎克羅諾捕獲抗體1.8mg/ml、羊抗鼠二抗0.6mg/ml分別作為檢測線6和控制線7，控制劃膜儀的噴速為0.8ul/cm，后置于37℃鼓風干燥箱中干燥1h取出，切成3mm寬的試紙條，裝入鋁箔袋中，加干燥劑密封，置于干燥缸中保存備用。

2.3奶粉樣品處理

100g奶粉和900ml預熱的nb培養基混合后，接種1ml10³cfu/ml的阪崎克羅諾桿菌，在37℃，200r/min條件下震蕩培養1-8h，將菌液濃度調整為10³cfu/ml，10⁴cfu/ml，10⁵cfu/ml，10⁶cfu/ml。分別取上述6種濃度的染菌乳樣10ml于4℃、12000r/min條件下離心10min后,盡量去除干凈上清及奶皮，以降低奶粉中蛋白質基質的干擾，將沉淀用1ml生理鹽水復溶。

2.4樣品預孵育

1)在酶標抗中分別加入100ul步驟4中所獲得6種濃度染菌樣品液和第一金標抗體(6ul，7ul，8ul，9ul)，室溫下孵育4min。

3)再加入第二金標抗體(6ul，7ul，8ul，9ul)，混勻。

2.5樣品上條檢測

將試紙條插入酶標孔中進行檢測，10min后觀察檢測結果。

若信號增強型試紙條b的檢測線6、控制線7都出現紅色條帶，表明可檢出此濃度的阪崎克羅諾桿菌，陽性結果；若檢測線6未出現紅色條帶，控制線7出現紅色條帶，表明不可檢出此濃度的阪崎克羅諾桿菌，陰性結果；若控制線7未出現紅色條帶，表明試紙條失效。

本發明試劑盒可以用于檢測檢測阪崎克羅諾桿菌。

2.6檢測結果

進行兩種金標抗體加入量的雙因素交叉實驗，結果如表3所示，第一金標抗體和第二金標抗體的加入量均在6ul-9ul的范圍內，檢測效果均較好，并且相較與其他結果當第一金標抗體與第二金標抗體加入量為1:1時靈敏度結果較好，且第一金標抗體與第二金標抗體加入量都為8ul是靈敏度提高效果最好，可檢測到10⁴cfu/ml,且檢測線顏色較深，可明顯觀察到結果，且無假陽性存在。

表3兩種金標抗體加入量優化結果

注：“－”陰性，“+”和“±”表示t線顯色的強度，“±”比“+”顯色弱，越多“+”表示顯色越強。

實施例2：本發明試劑盒的制備及應用

1、試劑盒的制備

本實施例提供了一種快速檢測阪崎克羅諾桿菌的試劑盒，該試劑盒包括酶標孔a、信號增強型試紙條b、第一金標抗體c和第二金標抗體d；信號增強型試紙條b包括樣品墊1、結合墊2、nc膜3、吸水墊4和底板5，nc膜3上設有檢測線6和控制線7，檢測線6上包被有抗阪崎克羅諾桿菌捕獲抗體，控制線7上包被有羊抗鼠二抗；第一金標抗體c上包被有抗阪崎克羅諾桿菌檢測抗體，且由bsa封閉結合位點；第二金標抗體d上包被有抗bsa抗體；第一金標抗體c和第二金標抗體d結合形成雙金標抗體。

第一金標抗體c(粒徑為26nm)的制備方法，即在膠體金上標記抗阪崎克羅諾單克隆檢測抗體，具體步驟為：取1ml26nm膠體金溶液加入0.2m碳酸鉀4ul調節溶液ph值，加入抗阪崎克羅諾單克隆檢測抗體8ug，混勻，室溫靜置反應1h以上后，加入封閉劑10％bsa100ul，混勻，室溫靜置反應1h以上；10℃，7000rpm，離心20min，去掉上清(上清一定要盡量吸取干凈)，加150ul復溶液(5％蔗糖、12％海藻糖、1％bsa和0.3％吐溫-20,且ph值為8.5的tris緩沖溶液)復溶沉淀并混勻。

第二金標抗體d(粒徑為42nm)的制備方法，即在膠體金上標記抗阪崎克羅諾單克隆檢測抗體，具體步驟為：每1ml膠體金溶液加入碳酸鉀調節溶液ph值后加入抗bsa抗體8ug，混勻，室溫靜置反應1h以上后，加入封閉劑10％100ul的人血清白蛋白，混勻，室溫靜置反應1h以上；10℃，6500rpm，離心20min后去掉上清，加150ul復溶液復溶沉淀并混勻即得第二金標抗體。

信號增強型試紙條b的組裝方法為：

樣品墊1及結合墊2先經過稀釋液(2％吐溫-20、0.1％氯化鈉、1％聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、0.5％酪蛋白，且ph值為8.5的tris緩沖溶液)處理，后置于65℃鼓風干燥箱中干燥1h取出備用。將結合墊2、nc膜3、吸水墊4分別黏貼在pvc板上，每兩個墊之間有2-3mm的交疊，在nc3膜上分別噴抗阪崎克羅諾捕獲抗體1.8mg/ml、羊抗鼠二抗0.6mg/ml分別作為檢測線6和控制線7，控制劃膜儀的噴速為0.8ul/cm，后置于37℃鼓風干燥箱中干燥1h取出，切成3mm寬的試紙條，裝入鋁箔袋中，加干燥劑密封，置于干燥缸中保存備用。

試劑盒的檢測方法包括如下步驟：

1)在酶標孔a中加入100ul樣品液和8ul第一金標抗體c，室溫下孵育4min；

2)再加入8ul第二金標抗體d，混勻；

3)將試紙條插入酶標孔a中進行檢測，10min后觀察檢測結果；

4)判定方法：若信號增強型試紙條b的檢測線6、控制線7都出現紅色條帶，表明樣品中含有阪崎克羅諾桿菌，陽性結果；若檢測線6未出現紅色條帶，控制線7出現紅色條帶，表明樣品中不含有阪崎克羅諾桿菌，陰性結果；若控制線7未出現紅色條帶，表明試紙條失效；其中檢測線6顏色越深，表明樣品中含有的阪崎克羅諾桿菌濃度越高。

本發明試劑盒可以用于檢測阪崎克羅諾桿菌。

2、試劑盒的性能試驗

利用1中制備的試劑盒進行如下性能試驗。

2.1試劑盒靈敏度實驗

2.1.1試劑盒檢測純菌(阪崎克羅諾桿菌)的檢測限的測定

將培養好10⁸cfu/ml阪崎克羅諾桿菌液用生理鹽水進行梯度稀釋至10⁷cfu/ml，10⁶cfu/ml，10⁵cfu/ml，10⁴cfu/ml，10³cfu/ml，10²cfu/ml，以生理鹽水作為陰性對照。

樣品預孵育方法：

1)在酶標抗中分別加入100ul上述制備的7種濃度染菌樣品液和8ul第一金標抗體，室溫下孵育4min。

2)再加入8ul第二金標抗體，混勻。

上條檢測：

將試紙條插入酶標孔中進行檢測，10min后觀察檢測結果。若信號增強型試紙條b的檢測線6出現紅色條帶，控制線7出現紅色條帶，可檢出此濃度的阪崎克羅諾桿菌；若檢測線6未出現紅色條帶，控制線7出現紅色條帶，不可檢出此濃度的阪崎克羅諾桿菌，陰性結果；若控制線7未出現紅色條帶，表明試紙條失效。

試劑盒純菌檢測限實驗結果：

測結果如圖2所示，使用該試劑盒可檢測到濃度為10³cfu/ml的純菌液，且無假陽性存。

2.1.2試劑盒檢測乳粉中阪崎克羅諾桿菌的檢測限的測定

奶粉樣品處理方法：

100g奶粉和900ml預熱的nb培養基混合后，接種1ml10³cfu/ml的阪崎克羅諾桿菌，在37℃，200r/min條件下震蕩培養1-8h，將菌液濃度調整為10³cfu/ml，10⁴cfu/ml，10⁵cfu/ml，10⁶cfu/ml，10⁷cfu/ml，10⁸cfu/ml。分別取上述6種濃度的染菌乳樣10ml于4℃、12000r/min條件下離心10min后,盡量去除干凈上清及奶皮，以降低奶粉中蛋白質基質的干擾，將沉淀用1ml生理鹽水復溶，以生理鹽水作為陰性對照。

樣品預孵育方法：

1)在酶標抗中分別加入100ul上述制備的6種濃度染菌樣品液和8ul第一金標抗體，室溫下孵育4min。

2)再加入8ul第二金標抗體，混勻。

樣品上條檢測：

將試紙條插入酶標孔中進行檢測，10min后觀察檢測結果。若信號增強型試紙條b的檢測線6出現紅色條帶，控制線7出現紅色條帶，可檢出乳樣中此濃度的阪崎克羅諾桿菌；若檢測線6未出現紅色條帶，控制線7出現紅色條帶，不可檢出乳樣中此濃度的阪崎克羅諾桿菌；若控制線7未出現紅色條帶，表明試紙條失效。

試劑盒檢測乳樣中阪崎克羅諾桿菌檢測限實驗結果：

檢測結果如圖3所示，使用該試劑盒可檢測到乳樣中濃度為10⁴cfu/ml的阪崎克羅諾桿菌，且無假陽性存。

2.2、試劑盒特異性實驗

針對7株克羅諾桿菌和16株非克羅諾桿菌(如表1)進行特異性驗證試驗來研究試劑條的特異性，其中選用7株克羅諾桿菌除阪崎克羅諾桿菌試驗的試紙條c線和t線均顯色，呈陽性外，其余16株非阪崎克羅諾桿菌試驗的試紙條c線和t線均顯色，呈陰性。說明本發明試劑盒對檢測阪崎克羅諾桿菌特異性強。

2.3、試劑盒的穩定性

將信號增強型試紙條分別置于常溫及60℃進行保藏實驗，測定試紙條的穩定性。每周取出常溫保存的試紙條，檢測阪崎克羅諾桿菌濃度為10³cfu/ml，10⁴cfu/ml，10⁵cfu/ml，10⁶cfu/ml，10⁷cfu/ml，10⁸cfu/ml，測其靈敏度。每天取出60℃保存的試紙條，檢測阪崎克羅諾桿菌濃度為10³cfu/ml，10⁴cfu/ml，10⁵cfu/ml，10⁶cfu/ml，10⁷cfu/ml，10⁸cfu/ml，測其靈敏度。

試紙條在常溫下保存12個月，靈敏度仍未發生變化；在60℃條件下存放7d時，仍能檢出10⁴cfu/ml濃度的阪崎克羅諾桿菌，60℃條件下存放7d相當于在常溫存放490d，所以說此試紙條靈敏度較好，在常溫條件下可存放一年以上，本發明試劑盒穩定性較好。

3、試劑盒檢測奶粉中阪崎克羅諾桿菌

本實施例隨機抽樣16份乳粉并且人工感染8份乳粉，利用上述1中制備的試劑盒實際檢測乳粉中的阪崎克羅諾桿菌，同時也利用國標法進行檢測，與試劑盒進行比較。具體方法如下：

1)100g奶粉和900ml預熱的nb培養基混合后，在37℃，200r/min條件下震蕩前增菌5h，取10ml于4℃、12000r/min條件下離心20min，盡量去除干凈上清及奶皮，以降低乳粉中蛋白質基質的干擾，將沉淀用1ml生理鹽水復溶。

2)取步驟1所得樣溶液100ul及第一金標抗體8ul于酶標孔中預孵育4min，使得第一金標抗體與樣品充分結合。

3)再向酶標孔中加入第二金標抗體8ul，混勻，使得第一金標抗體與第二金標抗體相連增強信號。

4)將試紙條插入步驟3中的酶標孔中，10min后觀察檢測結果：若信號增強型試紙條b的檢測線6、控制線7都出現紅色條帶，表明乳樣中含有阪崎克羅諾桿菌，陽性結果；若檢測線6未出現紅色條帶，控制線7出現紅色條帶，表明乳樣中不含有阪崎克羅諾桿菌，陰性結果；若控制線7未出現紅色條帶，表明試紙條失效；其中檢測線6顏色越深，表明乳樣中含有的阪崎克羅諾桿菌濃度越高。

檢測結果

使用該試劑盒進行檢測發現，該試劑盒可將8份人工污染樣品檢出，另外8份呈現陰性，與國標法檢測結果一致，正確率達100％，且總檢測過程僅需5h34min。

實施例3：本發明試劑盒的制備及與傳統試紙條制備及檢測靈敏度對比實驗

本實施例結合本發明的方法，制備一種傳統型試紙條作為對照實驗，與本發明的試劑盒進行比對，具體方法如下：

1、金標抗體的制備

取1ml26nm膠體金溶液加入0.2m碳酸鉀4ul調節溶液ph值，加入抗阪崎克羅諾單克隆檢測抗體8ug，混勻，室溫靜置反應1h以上后，加入封閉劑10％bsa100ul，混勻，室溫靜置反應1h以上；10℃，7000rpm，離心20min，去掉上清(上清一定要盡量取干凈)，加150ul復溶液(5％蔗糖、12％海藻糖、1％bsa和0.3％吐溫-20,且ph值為8.5的tris緩沖溶液)復溶沉淀并混勻。

2、組裝試紙條

樣品墊1及結合墊2先經過稀釋液(2％吐溫-20、0.1％氯化鈉、1％聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、0.5％酪蛋白，且ph值為8.5的tris緩沖溶液)處理，后置于65℃鼓風干燥箱中干燥1h取出備用。j將2.1中所制得的金標抗體噴在結合墊上制成金標墊，并置于37℃鼓風干燥箱中干燥1h。將樣品墊、金標墊、nc膜、吸收墊分別黏貼在pvc板上，每兩個墊之間有2-3mm的交疊，在nc膜上分別噴抗阪崎克羅諾捕獲抗體1.8mg/ml、羊抗鼠二抗0.6mg/ml分別作為檢測線(7)和控制線(8)，控制劃膜儀的噴速為0.8ul/cm，后置于37℃鼓風干燥箱中干燥1h取出，切成3mm寬的試紙條，裝入鋁箔袋中，加干燥劑密封，置于干燥缸中保存備用。

3、奶粉樣品處理

100g奶粉和900ml預熱的nb培養基混合后，接種1ml10³cfu/ml的阪崎克羅諾桿菌，在37℃，200r/min條件下震蕩培養1-8h，將菌液濃度調整為10³cfu/ml，10⁴cfu/ml，10⁵cfu/ml，10⁶cfu/ml，10⁷cfu/ml，10⁸cfu/ml。分別取上述6種濃度的染菌乳樣10ml于4℃、12000r/min條件下離心10min后,盡量去除干凈上清及奶皮，以降低奶粉中蛋白質基質的干擾，將沉淀用1ml生理鹽水復溶。

4、樣品上條檢測

取上述3中處理過的6種濃度的樣液100ul滴加在試紙條的樣品墊上進行檢測，10min后觀察檢測結果。若檢測線7出現紅色條帶,檢測線8出現紅色條帶，表明可檢出此濃度阪崎克羅諾桿菌；若檢測線7未出現紅色條帶，檢測線8出現紅色條帶，表明不可檢出此濃度阪崎克羅諾桿菌；若檢測線8未出現紅色條帶，表明試紙條失效。

檢測結果如圖4，最終獲得檢測靈敏度為10⁶cfu/ml，需前增菌7h。

利用傳統型試劑條對純阪崎克羅諾桿菌菌液進行檢測發現，使用該試劑盒可檢測到濃度為10⁵cfu/ml的純菌液。

綜上，本發明制備的試劑盒，相比于傳統型試紙條靈敏度提高了100倍，檢測限低；利用傳統的膠體金試紙條檢測需前增菌7h，利用此試劑盒則僅需5h前增菌時間，大大縮短了檢測所用時間。

雖然本發明已以較佳的實施例公開如上，但其并非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明精神和范圍內，都可以做各種的改動與修飾，因此，本發明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。