一種檢測克羅諾桿菌屬菌株的方法及其試劑盒和引物的制作方法

專利名稱：一種檢測克羅諾桿菌屬菌株的方法及其試劑盒和引物的制作方法
技術領域：
本發明涉及微生物檢測領域，具體涉及一種檢測克羅諾桿菌屬菌株的方法及其試劑盒和引物。
背景技術：
克羅諾桿菌屬(Cronobacter spp)是人和動物腸道內寄生的一種革蘭陰性無芽孢桿菌。作為一種重要的食源性條件致病菌，克羅諾桿菌屬菌株能夠引起嬰兒致命的感染，致死率高達10%_80%。它通常能導致嬰兒嚴重的臨床癥狀，例如腦膿瘍，腦膜炎，壞死性小腸結腸炎和全身性敗血癥。曾經有在嬰兒配方粉中分離到阪崎克羅諾桿菌菌株的報道。克羅諾桿菌屬菌株是通過配方粉危害嬰幼兒健康的重要條件性致病菌。新生嬰兒或早產兒都存在通過食用污染有克羅諾桿菌屬的嬰兒配方粉而感染克羅諾桿菌屬菌株的風險。在污染環節調查中發現，整個嬰幼兒配方粉生產工藝流程中，可檢測到克羅諾桿菌的污染點占到全部取樣點的31%。因此，對克羅諾桿菌屬菌株快速鑒定與鑒別是實現有效控制的基礎。該菌在1980年被首次命名和定義后，又于2008年由一個種被重新分為克羅諾桿菌新屬(Cronobacter spp·),屬下分為5個新種(其中Cronobacter sakazakii稱為新組合)、1個克羅諾桿菌基因種(Genomospeciese)和3個新亞種，盡管該菌的分類和名稱已變，但目前檢測仍然沿用程序式的阪崎腸桿菌標準檢測方法，以傳統生化反應進行鑒定，需要18-24h，而且無法區分為哪一種，這顯然已經不能滿足對克羅諾桿菌屬菌株檢測的需求。在鑒別方面，盡管已有擴增片段長度多態性分析(Amplified fragment length polymorphismas, AFLP)、16S rRNA全序列比較、DNA-DNA雜交實驗及多位點測序等多種可靠方法，但這些根據遺傳特征的分析方法耗時長、工作量大。因此，目前缺少對克羅諾桿菌屬菌株的高效率的鑒定與鑒別方法。發明內容
本發明要解決的技術問題在于克服現有傳統技術檢測時間長的缺陷，提供一種克羅諾桿菌屬菌株的PCR檢測方法、核酸及引物對。采用本發明的檢測方法檢測克羅諾桿菌屬菌株，檢測時間短，成本低，更加具有實用性，檢測結果特異，結果判定簡單。
本發明的技術方案如下
本發明的技術方案之一是一種檢測克羅諾桿菌屬菌株的方法，包括以下步驟
(I)提取待檢樣品的基因組DNA，以其為模板，以克羅諾桿菌屬特異性擴增引物對為引物，進行PCR擴增，所述的引物對中，一條引物的序列為SEQ ID NO. I所示，另一條引物的序列為SEQ ID NO. 2所不；和
(2)檢測438bp位置單一擴增產物的存在。
根據本發明，步驟(I)中，所述PCR中，PCR的反應體系較佳的為=IXPCR反應緩沖液，10-15mmol/L Mg2+，O. 2-0. 3mmol/L dNTP，0. 1-0. 3 μ M 引物 1，O. I-O. 3 μ M 引物 2，Taq 酶 O. 01-0. υ/μ L，DNA 模板 lO-lOOng/μ L。更佳的為:1 XPCR 反應緩沖液，12. 5mmol/L Mg2+，O.25mmol/L dNTP，O. 2 μ M 引物 I (SEQ ID NO. I)，0. 2 μ M 引物 2 (SEQ ID NO. 2)，Taq 酶0.04U/ μ L, DNA 模板 50ng/ μ L。
步驟(I)中，所述PCR中，PCR的擴增程序較佳的為92_95°C預變性3_6min，之后開始以下循環，每個循環的程序為92-95°C變性20-40s，60-65°C退火20_40s，70_74°C延伸20-40s ;循環共30-40個；循環結束后，70-74°C延伸8_12min，降溫至4_15°C，結束。更佳的為94°C預變性5min，之后開始以下循環，每個循環的程序為94°C變性30s，63°C退火 30s，72°C延伸30s ;循環共35個；循環結束后，72°C延伸lOmin，降溫至12°C，結束。
步驟(2)中，所述的檢測結果的判斷方法如下在檢測的結果中，如果存在438bp 位置的單一擴增產物，則說明待檢樣品中含有克羅諾桿菌菌屬菌株；如果不存在438bp位置的單一擴增產物，則待檢樣品中不含有克羅諾桿菌屬菌株。
步驟(2)中所述的檢測方法，可以是本領域常規的方法，優選的為凝膠電泳檢測法，可以是瓊脂糖凝膠，也可以是聚丙烯酰胺凝膠。
本發明的方法尤其適用于檢測食品中的克羅諾桿菌屬菌株，特別是奶粉中的克羅諾桿菌屬菌株的檢測。
本發明的技術方案之二是一種檢測克羅諾桿菌屬菌株的試劑盒，其包括一條序列為SEQ ID NO. I所示的引物和一條序列為SEQ ID NO. 2所示的引物。較佳的，還包括 IOXPCR緩沖液，Taq酶，dNTP溶液和MgCl2。所述的IOXPCR緩沖液，Taq酶，dNTP溶液和 MgCl2都如本領域常規所述。
本發明的技術方案之三是一種擴增克羅諾桿菌屬菌株的引物，其序列如SEQ ID NO. I所示或者如SEQ ID NO. 2所示。
在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實例。
本發明所用試劑和原料均市售可得。
本發明的積極進步效果在于采用本發明的檢測方法檢測克羅諾桿菌屬菌株，檢測時間短，降低了檢測成本；提高了檢測效率；本發明的檢測方法，具有單一特異性，檢測結果可靠，結果判定簡單。本發明為食品安全檢測技術領域提供了一種簡單快速靈敏的檢測克羅諾桿菌屬細菌的方法，對我國的食品安全具有較大意義。


圖I是實施例I中PCR產物經I. 5%瓊脂糖凝膠電泳實驗結果。泳道I 17依次為 阪崎克羅諾桿菌ATCC29544，穆汀斯克羅諾桿菌ATCC51329，鼠傷寒沙門氏菌ATCC14023，腸炎沙門氏菌ATCC13311，陰溝腸桿菌ATCC13047，大腸桿菌ATCC43889，大腸桿菌ATCC25922， 奇異變形桿菌ATCC12453，普通變形桿菌ATCC33420，枸櫞酸桿菌ATCC8090，肺炎克雷伯桿菌ATCC27336，肺炎克雷伯桿菌ATCC46114，宋志氏志賀氏菌CMCC51334，痢疾志賀氏菌 CMCC51335，福氏志賀氏菌 ATCC51371，綠膿桿菌 CDCB32116，IOObp DNA Marker。
圖2是實施列I中PCR產物經I. 5%瓊脂糖凝膠電泳圖譜。泳道I 17依次為 蠟樣芽胞桿菌ATCC1220，氣味沙雷氏菌ATCC33077，粘質沙雷氏菌ATCC14040，惡臭假單胞菌ATCC17485，產堿假單胞菌IQCC12604，金黃色葡萄球菌ATCC29213，金黃色葡萄球菌 ATCC8095,屎腸球菌ATCC14025，糞腸球菌ATCC49452，產氣腸桿菌ATCC13048，霍亂弧菌SJTU32001,副溶血弧菌ATCC17802,副溶血弧菌ATCC33846,創傷弧菌ATCC27562,單核增生李斯特菌AB97021,單核增生李斯特菌ATCC13313, IOObp DNA Marker。
圖3是實施列I中PCR產物經I. 5%瓊脂糖凝膠電泳圖譜。泳道I 17依次為 阪崎克羅諾桿菌ATCC29544，穆汀斯克羅諾桿菌ATCC51329，克羅諾桿菌基因種NCTC9529, 丙二酸鹽陽性克羅諾桿菌DSM18702，蘇黎世克羅諾桿菌DSM18703，都柏林克羅諾桿菌都柏林亞種DSM18705，都柏林克羅諾桿菌洛桑亞種DSM18706，都柏林克羅諾桿菌乳粉亞種 DSM18707,阪崎克羅諾桿菌BDCS001，阪崎克羅諾桿菌BDCS002，阪崎克羅諾桿菌BDCS003， 阪崎克羅諾桿菌BDCS004，阪崎克羅諾桿菌BDCS005，阪崎克羅諾桿菌BDCS006，阪崎克羅諾桿菌 BDCS007，阪崎克羅諾桿菌 BDCS008, IOObp DNA Marker。
圖4實施列I中是PCR產物經1. 5%瓊脂糖凝膠電泳圖譜。泳道I 17依次為阪崎克羅諾桿菌BDCS009，阪崎克羅諾桿菌BDCS010，阪崎克羅諾桿菌BDCSOlI，阪崎克羅諾桿菌 BDCSO12,阪崎克羅諾桿菌BDCS013，阪崎克羅諾桿菌BDCS014，阪崎克羅諾桿菌BDCS015，阪崎克羅諾桿菌BDCS016，阪崎克羅諾桿菌BDCS017，阪崎克羅諾桿菌BDCS018，阪崎克羅諾桿菌BDCS019，阪崎克羅諾桿菌BDCS020，阪崎克羅諾桿菌BDCS021，阪崎克羅諾桿菌BDCS022， 阪崎克羅諾桿菌BDCS023，阪崎克羅諾桿菌BDCS024，IOObp DNA Marker。
圖5是實施列I中PCR產物經I. 5%瓊脂糖凝膠電泳圖譜。泳道I 8依次為阪崎克羅諾桿菌BDCS025，阪崎克羅諾桿菌BDCS026，阪崎克羅諾桿菌BDCS027，阪崎克羅諾桿菌BDCS028，阪崎克羅諾桿菌BDCS029，阪崎克羅諾桿菌BDCS030，ddH20, IOObp DNA Marker。
圖6是實施列I中PCR產物經I. 5%瓊脂糖凝膠電泳驗證引物靈敏度實驗圖譜。 泳道 I 10 依次為IOObp DNA Marker, 141. Ong/PCR, 14. lng/PCR, I. 41ng/PCR, 141pg/ PCR, 14. lpg/PCR, I. 41pg/PCR, 141fg/PCR, 14. lfg/PCR,，ddH20。
具體實施方式
下面通過實施例的方式進一步說明本發明，但并不因此將本發明限制在所述的實施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照商品說明書選擇。
實施例I
克羅諾桿菌屬菌株PCR檢測方法
步驟一，引物合成
合成能夠PCR擴增克羅諾桿菌屬gyrB基因序列中的保守序列的引物(由上海生工生物工程技術服務有限公司合成)，引物序列如下
SEN2-L :5，-ATGGATAAAGAGGGCTACAG-3’ (SEQ ID N0:1),
SEN2-R :5，-CGCCTGATTCTTACGGTTAC-3，(SEQ ID NO:2)。
步驟二，PCR檢測方法的體系及反應參數
采用上述引物，以克羅諾桿菌屬標準菌株的基因組DNA為模板，進行PCR反應體系和反應程序的建立和優化，經過單因素、多因素試驗和雜交試驗，發現以下反應體系和反應程序都能得到單一的438bp左右的擴增產物。所述PCR反應體系為1XPCR反應緩沖液，10-15mmol/L Mg2+，O. 2-0. 3mmol/L dNTP，0. 1-0. 3 μ M 引物 1，O. I-O. 3 μ M 引物 2，Taq 酶 O. 01-0. IU/μ L，DNA 模板 lO—lOOng/μ L。所述 PCR 擴增程序為92_95°C預變性 3_6min,之后開始以下循環，每個循環的程序為92-95°C變性20-40s，60-65 °C退火20_40s，70-74 °C 延伸20-40s ;循環共30-40個；循環結束后，70-74°C延伸8_12min，降溫至4_15°C，結束。 而最優的反應體系和反應程序如下，其438bp左右的擴增產物的產量最高，電泳條帶最明顯清晰。最優的PCR反應體系為:1XPCR反應緩沖液，12. 5mmol/L Mg2+，O. 25mmol/L dNTP,0.2 μ M引物I，O. 2 μ M引物2，Taq酶O. 04U/ μ L，DNA模板40ng/ μ L。最優的PCR擴增程序為94°C預變性5min，之后開始以下循環，每個循環的程序為94 V變性30s，63 °C退火30s， 72°C延伸30s ;循環共35個；循環結束后，72°C延伸lOmin，降溫至12°C，結束。
因此，本發明建立了最優的PCR檢測方法如下先加入16. I μ L無菌水到反應管中，再依次加入 IOXPCR 反應緩沖液 2. 5 μ L，25mmol/L 的 Mg2+ 2. O μ L, 2. 5mmol/L 的 dNTP1.O μ L, 5 μ M引物I. O μ L, 2. 5U/μ L Taq酶O. 4 μ L,最后加模板溶液2 μ L,并以無菌水為模板作為反應的陰性對照。然后將反應管離心后，放入PCR反應儀中，按照以下PCR程序進行 在94°C預變性5min，接著作35個循環，每個循環的程序包括94°C變性30s，退火溫度63°C， 退火時間為30s，然后在72°C延伸30s，循環結束后在72°C延伸lOmin，最后降溫至12°C，結束所有操作程序。
步驟三，檢測
取阪崎克羅諾桿菌和丙二酸鹽陽性克羅諾桿菌等克羅諾桿菌屬標準菌株8株及 30株分離菌株(如表I所示，表中所示菌株均為本領域的技術人員可通過公開的渠道獲得的)，按照基因組DNA模板提取方法，分別提取基因組DNA。提取過程如下將阪崎克羅諾桿菌和丙二酸鹽陽性克羅諾桿菌等38株菌株(如表I所示)分別接種至50mL的TSB液體培養基中，在37°C增菌8h后,取ImL菌液，放入I. 5mL離心管中;之后在3，OOOr/min離心IOmin, 取上清液，再在12，OOOr/min離心5min,收集菌體。用無菌雙蒸水重新懸浮菌體，離心洗漆后加入100 μ L無菌超純水，在沸水浴中煮15min，立即取出，在-20°C放置30min。在37°C 解凍后，12，OOOr/min離心5min，取上清液放置_20°C備用。
每株菌株的DNA溶液(DNA濃度50ng/ μ L )均取2 μ L作為PCR反應模板添加到PCR 反應體系中進行擴增反應。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，判斷在438bp位置是否存在單一擴增條帶，結果見表1，電泳結果見圖1-5。
從表I中可知，除了克羅諾桿菌屬菌株的標準菌株和食品分離株外，其余陰性對照菌株均沒有特異擴增條帶。表I中，-:PCR結果為陰性；+ :PCR結果為陽性。表I中克羅諾桿菌屬(Cronobacter spp)使用了 8株標準菌株，代表了該屬內所有種的典型標準菌株。屬內包括6個種(其中Cronobacter sakazakii稱為新組合)，即阪崎克羅諾桿菌 ATCC25944，丙二酸鹽陽性克羅諾桿菌DSM18702，穆汀斯克羅諾桿菌ATCC51329，蘇黎世克羅諾桿菌DSM18703，克羅諾桿菌基因種1NCTC9529和都柏林克羅諾桿菌。其中都柏林克羅諾桿菌包括三個亞種，即都柏林克羅諾桿菌都柏林亞種DSM18705，都柏林克羅諾桿菌洛桑亞種DSM18706和都柏林克羅諾桿菌乳粉亞種DSM18707。克羅諾桿菌屬和腸桿菌屬的親緣關系最近，尤其和腸桿菌屬內的陰溝腸桿菌親緣關系最近。本次試驗共使用了腸桿菌屬標準菌株12株，志賀氏菌屬標準菌株3株，沙雷氏菌屬標準菌株2株，克雷伯屬標準菌株2株， 葡萄球菌屬標準菌株2株，假單胞菌屬標準菌株3株，李斯特菌屬標準菌株2株，弧菌屬標準菌株3株及分離菌株I株。所使用的這些菌株都是食源性致病菌，而且絕大多數都屬于腸桿菌科的，它們和克羅諾桿菌屬菌株具有較近的親緣關系。如果這些菌株經本發明的引物通過PCR實驗后擴增不到特異的片段，那么其它的和克羅諾桿菌屬菌株親緣關系較遠的菌株更加難以擴增到目的片段(438bp)，因此經過這些親緣關系較近的菌株的驗證，充分保證了本次試驗設計的引物的特異性。上述結果充分證明本發明的方法能擴增克羅諾桿菌屬的任何菌株，而不會擴增其它的任何菌株。
表I.特異性評價所用菌株及試驗結果
權利要求
1.一種檢測克羅諾桿菌屬菌株的方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)提取待檢樣品的基因組DNA，以其為模板，以克羅諾桿菌屬特異性擴增引物對為引物，進行PCR擴增，所述的引物對中，一條引物的序列為SEQ ID NO. I所示，另一條引物的序列為SEQ ID NO. 2所示；和 (2)檢測438bp位置單一擴增產物的存在。
2.如權利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(I)中，所述PCR中，PCR的反應體系為1 XPCR 反應緩沖液，10-15mmol/L Mg2+，O. 2-0. 3mmol/L dNTP，0. 1_0·3μΜ 引物 1，O.1-0. 3μ M 引物 2，Taq 酶 O. 01-0. lU/yL，DNA 模板 IO-IOOng/μ L0
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(I)中，所述PCR中，PCR的反應體系為I XPCR 反應緩沖液，12. 5mmol/L Mg2+，O. 25mmol/L dNTP，0. 2μΜ 引物 1，O. 2 μ M 引物 2，Taq酶 O. 04U/ μ L, DNA 模板 40ng/ μ L。
4.如權利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(I)中，所述PCR中，PCR的擴增程序為92-95°C預變性3-6min，之后開始以下循環，每個循環的程序為92_95°C變性20_40s，60-65 °C退火20-40s，70-74°C延伸20_40s ;循環共30-40個；循環結束后，70-74°C延伸8-12min，降溫至 4_15°C，結束。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(I)中，所述PCR中，PCR的擴增程序為94°C預變性5min，之后開始以下循環，每個循環的程序為94°C變性30s，63 °C退火30s，72°C延伸30s ;循環共35個；循環結束后，72°C延伸lOmin，降溫至12°C，結束。
6.如權利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(2)中所述的檢測方法為瓊脂糖凝膠電泳檢測法。
7.一種檢測克羅諾桿菌屬菌株的試劑盒，其特征在于，其包括一條序列為SEQ ID NO. I所示的引物和一條序列為SEQ ID NO. 2所示的引物。
8.如權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還包括10XPCR緩沖液，Taq酶，dNTP溶液和MgCl2。
9.一種擴增克羅諾桿菌屬菌株的引物，其特征在于，其序列如SEQ ID NO. I所示或者如SEQ ID NO. 2 所示。
全文摘要
本發明公開了一種檢測克羅諾桿菌屬菌株的方法及其檢測試劑盒。該方法包括以下步驟(1)提取待檢樣品的基因組DNA，以其為模板，以克羅諾桿菌屬特異性擴增引物對為引物，進行PCR擴增，所述的引物對中，一條引物的序列為SEQ ID NO.1所示，另一條引物的序列為SEQ ID NO.2所示；和(2)檢測438bp位置單一擴增產物的存在。本發明的方法，檢測克羅諾桿菌屬菌株時間短，降低了檢測成本，提高了檢測效率，具有單一特異性，檢測結果可靠，結果判定簡單。本發明為食品安全檢測技術領域提供了一種簡單快速靈敏的檢測克羅諾桿菌屬細菌的方法，對我國的食品安全具有較大意義。
文檔編號C12Q1/68GK102978291SQ201210572569
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月25日 優先權日2012年12月25日
發明者陳萬義, 艾連中, 任婧, 穆海菠, 杭鋒, 郭本恒, 李云飛 申請人:光明乳業股份有限公司