本發明涉及提取物的檢測
技術領域：
，尤其涉及一種桑葉提取物中1-脫氧野尻霉素含量的檢測方法。
背景技術：
：桑葉為桑科植物桑的干燥葉，栽培或野生，對土壤適應性強，全國大部分地區多有種植。桑葉味苦、甘，性寒。經研究發現，桑葉在藥理上具有抗炎、降血糖作用，并能夠降血脂、利尿。1-脫氧野尻霉素(dnj)是一種強的α-葡萄糖苷酶抑制劑，抑制小腸中的α-葡萄糖苷酶將人體從淀粉類食物中所分解來的蔗糖、麥芽糖等二糖分解成葡萄糖，能明顯抑制食后血糖急劇上升；1-脫氧野尻霉素(dnj)和桑葉黃酮協同作用能更有效抑制血糖上升，防治糖尿病及其并發的心腦血管疾病。目前最常用的dnj的檢測方法為從甘草提取物中分離制備出天然存在的高純度的24-羥基甘草酸，在此基礎上以9-芴基氯甲酸甲酯(fmoc-cl)對dnj進行柱前衍生化，再使用反相高效液相-紫外檢測器測定或者以9-芴基氯甲酸甲酯(fmoc-cl)標記dnj后反相高效液相-熒光檢測器檢測。中國專利cn201310015381.6和中國專利cn201410108293.5公開的就是上述兩種方法，存在兩個方面缺點：一方面對dnj進行柱前衍生化的操作過程復雜，條件不易把握；另一方面熒光檢測器價格昂貴，一般實驗室很少配置；因此該方法不易普及。此外中國專利cn201110309072.0公開了一種采用反相高效液相-紫外檢測器采用末端吸收的方法直接測定dnj的含量的方法；存在的缺陷是：紫外檢測器末端吸收干擾很大，對于含有雜質較多的樣品適用性較差。本發明提供了一種以反相高效液相-蒸發光散射檢測器(hplc-elsd)測定dnj含量的方法，elsd儀器價格適中，現在已經越來越多的用于含量測定，而且使用該方法不需要對dnj進行柱前衍生化和標記，操作簡單方便，重復性好。技術實現要素：發明目的：為了克服現有技術中存在的問題，本發明提出了一種操作簡單方便、具有良好的精密度、重現性和穩定性，使用前無需對1-脫氧野尻霉素進行柱前衍生化和標記且檢測儀器價格適中，普及推廣性好的桑葉提取物中1-脫氧野尻霉素含量的檢測方法。技術方案：為了解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案為：一種桑葉提取物中1-脫氧野尻霉素含量的檢測方法，具體采用反相高效液相色譜-蒸發光散射檢測方法進行，具體包括如下步驟：(1)液相色譜條件及系統適應性試驗：以氨基鍵合硅膠為填充劑，色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)；以乙腈溶液為流動相a，以6.5mmol乙酸銨溶液為流動相b；室溫20℃，相對濕度為25％-40％，柱溫25-40℃，流速0.8-1.2ml/min，進樣量20μl；以chromachem蒸發光散射器進行檢測，衰減設為5，靈敏度為中，霧化溫度30-40℃，蒸發溫度45-55℃；流動相梯度為：在0.01min，乙腈和6.5mmol乙酸銨溶液體積比為32-35:65-68；在0.01至10-15min段，乙腈和6.5mmol乙酸銨溶液體積比從32-35:65-68線性變化為35-45:55-65；在10-15至15-25min段，乙腈和6.5mmol乙酸銨溶液體積比從35-45:55-65線性變化為45-55:45-55；在15-25min至25-35min段，乙腈和6.5mmol乙酸銨溶液體積比從45-55:45-55線性變化為55-65:35-45；(2)對照品溶液的制備：精密稱取1-脫氧野尻霉素對照品，加乙腈溶液和6.5mmol乙酸銨溶液溶解制成不同濃度的對照品溶液i和對照品溶液ii，其中對照品溶液i的濃度為0.2-0.6mg/ml，對照品溶液ii的濃度為0.8-1.2mg/ml；(3)供試品溶液的制備：稱取桑葉提取物，加入乙腈和6.5mmol乙酸銨溶液配制成濃度為0.5-2mg/ml的供試品溶液，超聲溶解5-20min，放置至室溫，搖勻，即得；(4)測定法：將按照步驟(2)和(3)制得的對照品溶液i、對照品溶液ii和供試品溶液在步驟(1)的色譜檢測條件下注入高效液相色譜儀進行檢測，記錄色譜圖，然后計算桑葉提取物樣品中1-脫氧野尻霉素的含量。更為優選的，步驟(1)中所述相對濕度為35％。更為優選的，步驟(1)中所述柱溫為30℃。更為優選的，步驟(1)中所述流速為1.0ml/min。更為優選的，步驟(1)中所述霧化溫度為30℃，蒸發溫度為45℃。更為優選的，步驟(1)中所述流動相梯度為：在0.01min，乙腈和6.5mmol乙酸銨溶液體積比為35:65；在0.01至10min段，乙腈和6.5mmol乙酸銨溶液體積比從35:65線性變化為45:55；在10至20min段，乙腈和6.5mmol乙酸銨溶液體積比從45:55線性變化為55:45；在20至35min段，乙腈和6.5mmol乙酸銨溶液體積比從55:45線性變化為60:40。更為優選的，步驟(2)中所述對照品溶液i的濃度為0.5mg/ml，對照品溶液ii的濃度為1.0mg/ml。更為優選的，步驟(3)中所述供試品溶液濃度為1mg/ml。更為優選的，步驟(3)中所述超聲溶解時間為15min。更為優選的，步驟(4)中的計算桑葉提取物樣品中1-脫氧野尻霉素的含量具體方法為以對照品溶液ⅰ、以對照品溶液ⅱ的峰面積對數為橫坐標，濃度對數為縱坐標，做外標兩點法對數方程，計算得桑葉提取物中樣品中1-脫氧野尻霉素的含量。有益效果：本發明提供的一種桑葉提取物中1-脫氧野尻霉素含量的檢測方法，采用反相高效液相色譜-蒸發光散射檢測方法進行，選取氨基柱來對桑葉提取物中的1-脫氧野尻霉素進行分離，采用蒸發光散射檢測器配合檢測，并采用外標兩點法計算其中1-脫氧野尻霉素的含量。本發明的檢測方法，操作簡單方便、具有良好的精密度、重現性和穩定性，使用前無需對1-脫氧野尻霉素進行柱前衍生化和標記且檢測儀器價格適中，普及推廣性好且加樣回收率高，用于桑葉提取物中1-脫氧野尻霉素含量的檢測，對于桑葉提取物的質量控制提供了有效方法。具體實施方式下面結合實施例對本發明作進一步的詳細說明：下述實施例中所用檢測儀器和藥品如下：島津高效液相色譜儀，包括lc20at二元泵，spd20avp紫外檢測器，lc-solution色譜工作站。乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。1-脫氧野尻霉素對照品，批號為20161015，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；桑葉提取物樣品，批號為20170209，由江蘇耐雀生物工程技術有限公司提供。實施例1：一種桑葉提取物中1-脫氧野尻霉素含量的檢測方法，具體采用反相高效液相色譜-蒸發光散射檢測方法進行，具體包括如下步驟：(1)液相色譜條件及系統適應性試驗：以氨基鍵合硅膠為填充劑，島津inertsustainnh2色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)；以乙腈溶液為流動相a，以6.5mmol乙酸銨溶液為流動相b；室溫20℃，相對濕度為35％，柱溫30℃，流速1ml/min，進樣量20μl；以chromachem蒸發光散射器進行檢測，衰減設為5，靈敏度為中，霧化溫度30℃，蒸發溫度45℃；以表1的規定進行梯度洗脫：表1流動相洗脫梯度時間(分鐘)流動相a(％)流動相b(％)0.013565104555205545356040(2)對照品溶液的制備：分別精密稱取1-脫氧野尻霉素對照品5.13mg和10.21mg，分別置10ml量瓶中，加乙腈-6.5mmol乙酸銨溶液(35：65)溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液i和對照品溶液ii，其中對照品溶液i的濃度為0.5mg/ml，對照品溶液ii的濃度為1.0mg/ml；(3)供試品溶液的制備：稱取桑葉提取物50.32mg，置50ml量瓶中，乙腈-6.5mmol乙酸銨溶液(35：65)溶解配制成濃度為1mg/ml的供試品溶液，超聲溶解15min，放置至室溫，搖勻，即得；(4)測定法：分別精密吸取對照品溶液i、對照品溶液ii和供試品溶液各20μl，在步驟(1)的色譜檢測條件下注入高效液相色譜儀進行檢測，記錄色譜圖，然后以對照品溶液i、對照品溶液ii的峰面積對數為橫坐標，濃度對數為縱坐標，做外標兩點法對數方程，計算得桑葉提取物中1-脫氧野尻霉素的含量為24.35％。實施例2：一種桑葉提取物中1-脫氧野尻霉素含量的檢測方法，具體采用反相高效液相色譜-蒸發光散射檢測方法進行，具體包括如下步驟：(1)液相色譜條件及系統適應性試驗：以氨基鍵合硅膠為填充劑，島津inertsustainnh2色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)；以乙腈溶液為流動相a，以6.5mmol乙酸銨溶液為流動相b；室溫20℃，相對濕度為35％，柱溫25℃，流速0.8ml/min，進樣量20μl；以chromachem蒸發光散射器進行檢測，衰減設為5，靈敏度為中，霧化溫度35℃，蒸發溫度55℃；以表2的規定進行梯度洗脫：表2流動相洗脫梯度時間(分鐘)流動相a(％)流動相b(％)0.013268123565184555305545(2)對照品溶液的制備：分別精密稱取1-脫氧野尻霉素對照品3.06mg和8.18mg，分別置10ml量瓶中，加乙腈-6.5mmol乙酸銨溶液(35:65)溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液i和對照品溶液ii，其中對照品溶液i的濃度為0.3mg/ml，對照品溶液ii的濃度為0.8mg/ml；(3)供試品溶液的制備：稱取桑葉提取物25.22mg，置50ml量瓶中，乙腈-6.5mmol乙酸銨溶液(35：65)溶解配制成濃度為0.5mg/ml的供試品溶液，超聲溶解10min，放置至室溫，搖勻，即得；(4)測定法：分別精密吸取對照品溶液i、對照品溶液ii和供試品溶液各20μl，在步驟(1)的色譜檢測條件下注入高效液相色譜儀進行檢測，記錄色譜圖，然后以對照品溶液i、對照品溶液ii的峰面積對數為橫坐標，濃度對數為縱坐標，做外標兩點法對數方程，計算得桑葉提取物中1-脫氧野尻霉素的含量為22.17％。實施例3：一種桑葉提取物中1-脫氧野尻霉素含量的檢測方法，具體采用反相高效液相色譜-蒸發光散射檢測方法進行，具體包括如下步驟：(1)液相色譜條件及系統適應性試驗：以氨基鍵合硅膠為填充劑，島津inertsustainnh2色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)；以乙腈溶液為流動相a，以6.5mmol乙酸銨溶液為流動相b；室溫20℃，相對濕度為35％，柱溫40℃，流速1.2ml/min，進樣量20μl；以chromachem蒸發光散射器進行檢測，衰減設為5，靈敏度為中，霧化溫度40℃，蒸發溫度55℃；以表3的規定進行梯度洗脫：表3流動相洗脫梯度(2)對照品溶液的制備：分別精密稱取1-脫氧野尻霉素對照品6.05mg和12.14mg，分別置10ml量瓶中，加乙腈-6.5mmol乙酸銨溶液(35：65)溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液i和對照品溶液ii，其中對照品溶液i的濃度為0.6mg/ml，對照品溶液ii的濃度為1.2mg/ml；(3)供試品溶液的制備：稱取桑葉提取物99.98mg，置50ml量瓶中，乙腈-6.5mmol乙酸銨溶液(35：65)溶解配制成濃度為2mg/ml的供試品溶液，超聲溶解20min，放置至室溫，搖勻，即得；(4)測定法：分別精密吸取對照品溶液i、對照品溶液ii和供試品溶液各20μl，在步驟(1)的色譜檢測條件下注入高效液相色譜儀進行檢測，記錄色譜圖，然后以對照品溶液i、對照品溶液ii的峰面積對數為橫坐標，濃度對數為縱坐標，做外標兩點法對數方程，計算得桑葉提取物中1-脫氧野尻霉素的含量為23.69％。應當指出，以上具體實施方式僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍，在閱讀了本發明之后，本領域技術人員對本發明的各種等價形式的修改均落于本申請所附權利要求所限定的范圍。當前第1頁12