一種合相色譜?串聯質譜法測定無煙氣煙草制品中降煙堿對映異構體含量的方法與流程

本發明屬于理化分析技術領域，具體涉及一種合相色譜-串聯質譜法測定無煙氣煙草制品中降煙堿對映異構體含量的方法。

背景技術：

降煙堿是無煙氣煙草制品中的主要生物堿之一，對無煙氣煙草制品品質有重要影響，并是煙草特有亞硝胺——亞硝基降煙堿（nnn）的前體物質。降煙堿分子含有一個手性中心，所以降煙堿有兩個對映體：s-(-)-降煙堿（簡稱s-降煙堿）和r-(+)-降煙堿（簡稱r-降煙堿）。根據對映異構體的特性，降煙堿的兩個對映對映體可能具有完全不同的代謝機理和生理特性。因此，有必要對無煙氣煙草制品中降煙堿的對映異構體含量進行分析測定。

目前，文獻報道降煙堿對映異構體的測定方法主要有氣相色譜-質譜聯用法（gc-ms，beitr?gezurtabakforschung.2013;25(7):649-659.chirality.1999;11(1):82-84.）、多維氣相色譜-質譜聯用法（mdgc-ms，j.chromatogr.b.2008;865(1):13-17.）、毛細管電泳法（ce，electrophoresis.2009;30(2):349–356.）等，但是，gc-ms和mdgc-ms需要在前處理過程中進行衍生化，費時費力，ce僅使用保留時間進行定性，定性能力相對較差，容易出現假陽性結果。因此有必要開發一種靈敏度高、精密度好、適合大批量準確定量無煙氣煙草制品中s-降煙堿和r-降煙堿的方法。

技術實現要素：

本發明的目的正是基于上述技術不足，建立了一種合相色譜-串聯質譜法測定無煙氣煙草制品中降煙堿對映異構體含量的方法。本方法在前處理過程中不需要衍生化過程，實現了s-降煙堿和r-降煙堿的基線分離，并使用二級質譜進行定性和定量，避免出現假陽性結果，所以，本方法具有操作簡便、靈敏度高、準確定好等優點。

本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：

將無煙氣煙草制品樣品干燥、粉碎和過篩，樣品經過氫氧化鈉溶液浸潤后，采用二氯甲烷萃取，萃取液經基質分散固相萃取凈化后，使用串聯手性柱-合相色譜-串聯質譜法分析，采用峰面積歸一化法定量檢測無煙氣煙草制品中s-降煙堿和r-降煙堿的比例。

具體步驟如下：

1.標準溶液的配制

稱取約100.0mg的s-(-)-降煙堿標準品，用甲醇溶液稀釋定容到50ml棕色容量瓶中，配制成濃度約為2.0mg/ml的s-(-)-降煙堿標準儲備液；稱取約100.0mg的r-(+)-降煙堿標準品，用甲醇溶液稀釋定容到50ml棕色容量瓶中，配制成濃度約為2.0mg/ml的r-(+)-降煙堿標準儲備液；利用s-(-)-降煙堿標準儲備液和r-(+)-降煙堿標準儲備液稀釋配制s-(-)-降煙堿和r-(+)-降煙堿濃度分別為100μg/ml和100μg/ml的混合標準溶液

2.無煙氣煙草制品樣品的混勻

將無煙氣煙草制品樣品置于40℃烘箱中，1小時后將無煙氣煙草制品取出，粉碎后過0.45毫米孔徑標準篩。

3.無煙氣煙草制品樣品的萃取

選擇正己烷、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷五種溶劑進行萃取效率的比較。結果發現，二氯甲烷對降煙堿的萃取效率最高，甲基叔丁基醚和乙酸乙酯次之，正己烷和三氯甲烷的萃取效率最差，故選擇二氯甲烷為最終的萃取溶劑。

優化的萃取步驟為：

稱取0.3g已粉碎的樣品于15ml具塞離心管中，加入2.0ml5%的氫氧化鈉溶液（質量比），渦旋1min混勻后靜置10min浸潤樣品，取10ml二氯甲烷到離心管中，并于旋渦混合器上以4000rpm速度振蕩30min。

4.萃取液的凈化

取1.5ml上清液于2ml凈化離心管中（內含150mg無水硫酸鎂，50mgpsa吸附劑，25mggcb吸附劑，統稱基質分散固相萃取材料），于旋渦混合器上以4000rpm振蕩2min，以10000rpm離心1min。取上清液過0.45μm有機相濾膜后進液相分析。

5.串聯手性柱-合相色譜-串聯質譜法條件

分析柱1為trefoilcel1柱（柱長150mm，內徑3.0mm，固定相粒徑2.5μm），分析柱2為chiralcelod-h液相色譜柱(柱長250mm，內徑4.6mm，固定相粒徑5μm)；流動相a為：co2，流動相b：含0.05%異丙胺的甲醇；流速為1.0ml/min；梯度洗脫條件為：0.0min，97%a；0.5min，97%a；8.0min，92%a；12.0min，92%a；30.0min，90%a。柱溫40℃；進樣室溫度：10℃；進樣體積2μl；背壓：1600psi；ism補償流路流動相為含0.1%甲酸的甲醇，流速為0.3ml/min。分析時間總計30min。質譜條件：離子源：電噴霧源，掃描方式為正離子掃描，離子源溫度為300℃，電噴霧電壓為5000v，霧化氣壓力為40psi；檢測方式：多反應監測（mrm）；mrm參數見下表1。通過對峰面積進行歸一化定量s-降煙堿和r-降煙堿占總降煙堿的比例。

6.檢出限和定量限

在優化條件下，按照目標物信噪比為3時對應的濃度作為檢出限，按照目標物信噪比為10時對應的濃度作為檢出限。s-降煙堿的檢出限和定量限分別為0.12μg/g和0.40μg/g，r-降煙堿的檢出限和定量限分別為0.12μg/g和0.40μg/g。

7.精密度

取同一無煙氣煙草制品樣品進行5次日內和日間平行測定，考察了本發明方法的精密度，結果見表2和表3。結果表明，無煙氣煙草制品樣品中s-降煙堿的日內和日間測定結果的變異系數分別為1.08%和2.45%，精密度較好。

本發明提供了一種無煙氣煙草制品中降煙堿的手性分析合相色譜串聯質譜法，具有以下優良效果：①首次使用合相色譜-串聯質譜法檢測方法測定無煙氣煙草制品中降煙堿對映異構體含量，該方法與文獻報道測定降煙堿對映異構體含量的方法相比，具有靈敏度高，特異性好的優點，可避免假陽性結果，且分離度好，能實現對s-降煙堿和r-降煙堿的基線分離；②通過萃取溶劑的優化，使用二氯甲烷作為萃取溶劑，萃取效率最佳；③通過萃取液的凈化，可降低樣品液對色譜柱的污染；④分析時間短，能夠滿足大批量無煙氣煙草制品中降煙堿的手性分析。

附圖說明

圖1為不同萃取溶劑對目標化合物的萃取效率示意圖。

圖2為混合標準溶液的色譜圖。

圖3為典型無煙氣煙草制品樣品的色譜圖。

具體實施方式

本發明通過以下具體實施例作進一步描述，但不限制本發明。

實施例1：

1.儀器及試劑

acquityupc2超高效合相色譜儀（美國waters公司），6410b三重串聯四級桿質譜儀（美國agilent公司），ae163電子天平（感量：0.0001g，瑞士mettler公司），高速粉碎機（武漢銀彩科技有限公司），美國coleparmervotex-genie渦旋振蕩器，德國sigma3-30k-高速臺式冷凍型離心機。二氯甲烷（色譜純），氫氧化鈉（分析純），甲酸（色譜純），甲醇（色譜純），s-降煙堿標準品，r-降煙堿標準品。

2.樣品前處理

（1）無煙氣煙草制品樣品的混勻：將無煙氣煙草制品樣品置于40℃烘箱中，1小時后將無煙氣煙草制品取出，粉碎后過0.45毫米孔徑標準篩。

（2）無煙氣煙草制品樣品的萃取：稱取0.3g已粉碎的樣品于15ml具塞離心管中，加入2.0ml5%的氫氧化鈉溶液，渦旋1min混勻后靜置10min浸潤樣品。取10ml二氯甲烷到離心管中，并于旋渦混合器上以4000rpm速度振蕩30min。

（3）萃取液的凈化：取1.5ml上清液于2ml凈化離心管中（內含150mg無水硫酸鎂，50mgpsa吸附劑，25mggcb吸附劑），于旋渦混合器上以4000rpm振蕩2min，以10000rpm離心1min。取上清液過0.45μm有機相濾膜后進液相分析。

3.標準溶液的配制

稱取約100.0mg的s-(-)-降煙堿標準品，用甲醇溶液稀釋定容到50ml棕色容量瓶中，配制成濃度約為2.0mg/ml的s-(-)-降煙堿標準儲備液；稱取約100.0mg的r-(+)-降煙堿標準品，用甲醇溶液稀釋定容到50ml棕色容量瓶中，配制成濃度約為2.0mg/ml的r-(+)-降煙堿標準儲備液；利用s-(-)-降煙堿標準儲備液和r-(+)-降煙堿標準儲備液稀釋配制s-(-)-降煙堿和r-(+)-降煙堿濃度分別為100μg/ml和100μg/ml的混合標準溶液

4.儀器分析條件

分析柱1為trefoilcel1柱（柱長150mm，內徑3.0mm，固定相粒徑2.5μm），分析柱2為chiralcelod-h液相色譜柱(柱長250mm，內徑4.6mm，固定相粒徑5μm)；流動相a為：co2，流動相b：含0.05%異丙胺的甲醇；流速為1.0ml/min；梯度洗脫條件為：0.0min，97%a；0.5min，97%a；8.0min，92%a；12.0min，92%a；30.0min，90%a。柱溫40℃；進樣室溫度：10℃；進樣體積2μl；背壓：1600psi；ism補償流路流動相為含0.1%甲酸的甲醇，流速為0.3ml/min。分析時間總計30min。質譜條件：離子源：電噴霧源，掃描方式為正離子掃描，離子源溫度為300℃，電噴霧電壓為5000v，霧化氣壓力為40psi；檢測方式：多反應監測（mrm）；mrm參數見表1。

對峰面積進行歸一化定量s-降煙堿和r-降煙堿占總降煙堿的比例。

根據上述測定方法，選擇5種無煙氣煙草制品樣品，測得s-降煙堿的比例分別為61.84%、67.28%、65.84%、62.26%和67.35%。