的HAuCljK溶液逐滴加入，繼續反應20 min，直到溶液的顏色穩定，冷卻到室溫，加入飽和NaCl來除去AgCl固體，以10000 rpm轉速離心分離15 min，用水洗滌數次后，將其重新分散到超純水中，得到金納米籠的溶液；
(3)檢測抗體標記物一金納米籠/氨基化石墨烯的制備
分別將15 mg的氨基化石墨烯分散到10 mL的金納米籠的溶液中，室溫下震蕩12 h;混合物經洗滌、離心分離、35°C下真空干燥，制得金納米籠/氨基化石墨烯；
(4)檢測抗體孵化物一金納米籠/氨基化石墨烯-Ab2溶液的制備
將I mg的金納米籠/氨基化石墨稀分散于I mL超純水中，加入I mL、8 yg/mL的檢測抗體溶液，在4°C下振蕩孵化12 h，離心分離，將下層沉淀加入至I mL、l/15 mol/L的pH=7.4磷酸鹽緩沖溶液中，制得檢測抗體孵化物一金納米籠/氨基化石墨烯-Ab2溶液，40C下保存備用。
[0015]實施例5檢測抗體孵化物一金納米籠/氨基化石墨烯-Ab2溶液的制備
(1)銀納米立方體的制備
將5 mL的無水乙二醇置于燒瓶中，160°C下加熱I h，在攪拌下，將3 mL、0.25 mol/LAgNOj^乙二醇溶液和3 mL、0.19 mol/L聚乙烯吡咯烷酮的乙二醇溶液同時加入到燒瓶中，繼續反應40 min,冷卻至室溫，用乙醇和超純水洗滌后重新分散到超純水中，得到銀納米立方體的溶液；
(2)金納米籠的制備
取100 μ L銀納米立方體溶液加入到5 mL的超純水中，100°C下回流10 min，攪拌下將I mL、l mmol/L的HAuCljK溶液逐滴加入，繼續反應20 min，直到溶液的顏色穩定，冷卻到室溫，加入飽和NaCl來除去AgCl固體，以10000 rpm轉速離心分離15 min，用水洗滌數次后，將其重新分散到超純水中，得到金納米籠的溶液；
(3)檢測抗體標記物一金納米籠/氨基化石墨烯的制備
分別將20 mg的氨基化石墨烯分散到30 mL的金納米籠的溶液中，室溫下震蕩12 h;混合物經洗滌、離心分離、35°C下真空干燥，制得金納米籠/氨基化石墨烯；
(4)檢測抗體孵化物一金納米籠/氨基化石墨烯-Ab2溶液的制備
將2 mg的金納米籠/氨基化石墨稀分散于I mL超純水中，加入I mL、10 μ g/mL的檢測抗體溶液，在4°C下振蕩孵化12 h，離心分離，將下層沉淀加入至I mL、l/15 mol/L的pH=7.4磷酸鹽緩沖溶液中，制得檢測抗體孵化物一金納米籠/氨基化石墨烯-Ab2溶液，40C下保存備用。
[0016]實施例6檢測抗體孵化物一金納米籠/氨基化石墨烯-Ab2溶液的制備
(1)銀納米立方體的制備
將5 mL的無水乙二醇置于燒瓶中，160°C下加熱I h，在攪拌下，將5 mL、0.25 mol/LAgNOj^乙二醇溶液和3 mL、0.19 mol/L聚乙烯吡咯烷酮的乙二醇溶液同時加入到燒瓶中，繼續反應40 min,冷卻至室溫，用乙醇和超純水洗滌后重新分散到超純水中，得到銀納米立方體的溶液；
(2)金納米籠的制備
取200 μ L銀納米立方體溶液加入到5 mL的超純水中，100°C下回流10 min，攪拌下將2 mL、l m mol/L的HAuCljK溶液逐滴加入，繼續反應20 min，直到溶液的顏色穩定，冷卻到室溫，加入飽和NaCl來除去AgCl固體，以10000 rpm轉速離心分離15 min，用水洗滌數次后，將其重新分散到超純水中，得到金納米籠的溶液；
(3)檢測抗體標記物一金納米籠/氨基化石墨烯的制備
分別將25 mg的氨基化石墨烯分散到40 mL的金納米籠的溶液中，室溫下震蕩12 h;混合物經洗滌、離心分離、35°C下真空干燥，制得金納米籠/氨基化石墨烯；
(4)檢測抗體孵化物一金納米籠/氨基化石墨烯-Ab2溶液的制備
將3 mg的金納米籠/氨基化石墨稀分散于I mL超純水中，加入I mL、12 μ g/mL的檢測抗體溶液，在4°C下振蕩孵化12 h，離心分離，將下層沉淀加入至I mL、l/15 mol/L的pH=7.4磷酸鹽緩沖溶液中，制得檢測抗體孵化物一金納米籠/氨基化石墨烯-Ab2溶液，40C下保存備用。
[0017]實施例7禽類皰瘆病毒抗原的檢測
(1)使用電化學工作站用三電極體系進行測定，將權利要求1所制備的免疫傳感器作為工作電極，飽和甘汞電極為對電極，鉑絲電極為輔助電極，在pH=7.0的磷酸鹽緩沖溶液中，采用時間-電流的方法進行掃描，輸入電壓為-0.4 V，運行時間400 S，記錄電流變化；
(2)在10mL, pH=7.0的磷酸鹽緩沖溶液中對0.001-50 ng/mL的禽類皰瘆病毒抗原標準溶液進行測試記錄電流變化，根據所得電流差值與禽類皰瘆病毒抗原的濃度成線性關系，繪制工作曲線；
(3)將待測樣品溶液代替禽類皰瘆病毒抗原標準溶液進行檢測，測得線性范圍為
0.001-50 ng/mL，檢測限為 0.31 pg/mL。
【主權項】
1.一種基于金納米籠/氨基化石墨烯構建禽類皰瘆病毒抗原免疫傳感器的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)依次用1.0,0.3,0.05 Mm的三氧化二鋁拋光粉對玻碳電極拋光處理，用超純水清洗干凈，然后將電極置于5 mmol/L鐵氰化鉀溶液中，在-0.2-0.6 V電位下掃描，使峰電位差小于110 mV ； (2)以2mL質量分數為1%的HAuCl4為底液，在電壓為-0.2V下掃描30s，得到電沉積金納米粒子的電極； (3)滴加6μ?、5~10 Pg/mL的禽類皰瘆病毒抗原捕獲抗體Abi，4°C下晾干，超純水沖洗； (4)繼續滴加3μ?、質量分數為0.2-1%的牛血清白蛋白溶液至電極表面，4°C下晾干，超純水沖洗； (5)繼續滴加6μ?的一系列不同濃度的禽類皰瘆病毒抗原溶液至電極表面，4°C下晾干，超純水沖洗； (6)繼續滴加4~6μ?檢測抗體孵化物一金納米籠/氨基化石墨烯-Ab2S液至電極表面，置于4°C冰箱中孵化I h，清洗后，晾干，制得一種基于金納米籠/氨基化石墨烯構建禽類皰瘆病毒抗原免疫傳感器。
2.如權利要求1所述的一種基于金納米籠/氨基化石墨烯構建禽類皰瘆病毒抗原免疫傳感器的制備方法，所述檢測抗體孵化物一金納米籠/氨基化石墨烯-Ab2S液的制備，其特征在于，包括以下步驟: (1)銀納米立方體的制備 將5 mL的無水乙二醇置于燒瓶中，160°C下加熱I h，在攪拌下，將1~5 mL、0.25 mol/LAgNOj^乙二醇溶液和3 mL、0.19 mol/L聚乙烯吡咯烷酮的乙二醇溶液同時加入到燒瓶中，繼續反應40 min，冷卻至室溫，用乙醇和超純水洗滌后重新分散到超純水中，得到銀納米立方體的溶液； (2)金納米籠的制備 取50~200 μ L銀納米立方體溶液加入到5 mL的超純水中，100°C下回流10 min，攪拌下將0.05~2 mL、l m mol/L的HAuCljK溶液逐滴加入，繼續反應20 min，直到溶液的顏色穩定，冷卻到室溫，加入飽和NaCl來除去AgCl固體，以10000 rpm轉速離心分離15 min，用水洗滌數次后，將其重新分散到超純水中，得到金納米籠的溶液； (3)檢測抗體標記物一金納米籠/氨基化石墨烯的制備 分別將15~25 mg的氨基化石墨烯分散到10~40 mL的金納米籠的溶液中，室溫下震蕩12h ;混合物經洗滌、離心分離、35°C下真空干燥，制得金納米籠/氨基化石墨烯； (4)檢測抗體孵化物一金納米籠/氨基化石墨烯-Ab2溶液的制備 將1~3 mg的金納米籠/氨基化石墨稀分散于I mL超純水中，加入I mL、8~12 μ g/mL的檢測抗體溶液，在4°C下振蕩孵化12 h，離心分離，將下層沉淀加入至I mL、l/15 mol/L的pH=7.4磷酸鹽緩沖溶液中，制得檢測抗體孵化物一金納米籠/氨基化石墨烯-Ab2S液，4°C下保存備用。
3.如權利要求1所述的制備方法制備的免疫傳感器用于禽類皰瘆病毒抗原的檢測方法，其特征在于，包括以下分析步驟: (1)使用電化學工作站用三電極體系進行測定，將權利要求1所制備的免疫傳感器作為工作電極，飽和甘汞電極為對電極，鉑絲電極為輔助電極，在pH=7.0的磷酸鹽緩沖溶液中，采用時間-電流的方法進行掃描，輸入電壓為-0.4 V，運行時間400 S，記錄電流變化； (2)在10mL，pH=7.0的磷酸鹽緩沖溶液中對0.001-50 ng/mL的禽類皰瘆病毒抗原標準溶液進行測試記錄電流變化，根據所得電流差值與禽類皰瘆病毒抗原的濃度成線性關系，繪制工作曲線； (3)將待測樣品溶液代替禽類皰瘆病毒抗原標準溶液進行檢測。
【專利摘要】<b/>本發明涉及一種基于金納米籠/氨基化石墨烯構建禽類皰疹病毒抗原免疫傳感器的制備方法及應用，屬于新型功能材料、生物傳感檢測技術領域。具體是基于金納米籠和氨基化石墨烯復合材料制備出夾心型電化學免疫傳感器。氨基化石墨烯具有較高的比表面積、金納米籠具有優良的催化性能，該復合材料生物相容性好，催化效率高，可顯著提高免疫傳感器的靈敏度和穩定性。
【IPC分類】G01N27-327, G01N33-569, G01N33-543
【公開號】CN104849454
【申請號】CN201510248747
【發明人】李娜, 魏琴, 馬洪敏, 吳丹, 閆濤, 龐雪輝, 胡麗華, 李賀, 杜斌
【申請人】濟南大學
【公開日】2015年8月19日
【申請日】2015年5月16日