一種檢測污染水體遺傳毒性的生物學方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及環境保護領域的水質監測方法，具體涉及一種用DNA氧化損傷產物-8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)為標志物定量評價污染水體遺傳毒性效應的測試方法。
【背景技術】
[0002]20世紀以來，隨著化工行業的迅速發展，大量已知或新合成的有毒有害化學物質不斷排入水環境造成嚴重污染，對人類與環境生物的健康造成嚴重影響。在這些眾多污染物中，有相當部分對人體與環境生物具有遺傳毒性效應，可導致機體產生腫瘤甚至癌癥疾病。這類污染物不僅能損傷生物體的遺傳物質而誘發癌變，甚至還能通過生殖垂直傳遞給后代而危害人類與環境生物的基因庫。因此，部分發達國家已經對飲用水源水或污染水體的遺傳毒性進行監測。但是，我國尚未納入常規水源監測工作，其主要原因是水體遺傳毒性監測方法比較復雜繁。
[0003]有大量研宄表明，工業有機污染物、農藥、重金屬、環境毒素等多種外源性環境污染物都可以對生物體造成遺傳毒性效應。這些外源性環境污染物進入生物體內均可誘導機體產生大量氧自由基(ROS)，攻擊體內的DNA等生物大分子，改變其結構和功能，并最終導致基因突變、細胞癌變及生成腫瘤等現象。DNA氧化損傷是外源性環境污染物導致遺傳毒性的最常見生物學機制。8-羥基脫氧鳥苷(8-0HdG)是活性氧自由基(如羥自由基、單線態氧等)攻擊DNA分子中的鳥嘌呤第8位碳原子而產生的一種氧化性加合物，是活性氧基團引起DNA氧化損傷修飾產物之一。一旦逃避了機體自身修復，它可以進一步導致堿基錯配與基因突變，進而改變基因表達產物的結構和功能，就可能成為致突變、致畸及致癌的啟動因子。8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)是機體的代謝終產物，在生物體內可穩定存在；而且8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)只能通過DNA氧化損傷途徑形成，它在生物體液中的濃度水平不受飲食等因素影響。因此，8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)是目前國際上公認的一種新型評價DNA氧化損傷的敏感生物標志物。
[0004]本發明基于DNA氧化損傷是外源性污染物導致生物體遺傳毒性的最常見生物學機制，以DNA氧化損傷產物8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)為標志物，檢測污染水體對魚類體內的DNA氧化損傷程度，并以4-硝基喹啉-1-氧化物(4-NQ0)或苯并[a]芘為陽性參照物，定量評價污染水體的遺傳毒性效應。該方法可綜合評價污染水體對生物的遺傳毒性效應，具有操作簡單、實驗周期短、反應靈敏、重現性好等優點，非常適用于各種類型污染水體的遺傳毒性定量評價，將在水質監測工作中有廣闊的應用前景。
【發明內容】
[0005]1.發明要解決的技術問題
[0006]水體中具有遺傳毒性效應的污染物質種類繁多，采用化學分析方法只能分析檢測少數有限的幾種，無法對污染水體的遺傳毒性效應進行全面綜合評價。本發明以8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)為生物標志物，建立一種快速、準確地綜合評價污染水體遺傳毒性效應的技術方法。
[0007]2.本發明的技術方案
[0008]基于外源性環境污染物對生物體內DNA氧化損傷是導致遺傳毒性的最常見生物學機制，本發明的原理是將魚類生物在受試水體進行暴露試驗，采用酶聯免疫(ELISA)試劑盒或色譜法檢測經過受試水體暴露處理的魚體內DNA氧化損傷標志物8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)含量，然后與空白對照組的正常含量值進行比較，評價受試水體的遺傳毒性效應。生物體內8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)含量變化程度可直觀反映出受試水體的遺傳毒性效應大小。
[0009]本發明的技術方案為:
[0010]一種檢測污染水體遺傳毒性的生物學方法，步驟如下:
[0011]第一步、馴養試驗:將實驗用魚放置在經24小時曝氣除氯且經活性炭吸附處理的自來水或標準配制稀釋水中進行馴養7-10天；
[0012]第二步、暴露試驗:在裝有待測水樣的玻璃燒杯中放置一定數量的實驗用魚進行暴露實驗，暴露時間為7-14天；
[0013]第三步、8-OHdG檢測:取全魚或部分器官組織放置燒杯中，然后用勻漿機進行充分勻漿；勻漿液轉入離心管，在5000-1000rpm條件下離心5_10分鐘后取上清液，用酶聯免疫(ELISA)試劑盒或色譜法檢測上清液中的8-OHdG濃度，計算實驗用魚體內8-OHdG濃度；
[0014]第四步、標準曲線制作:以4-硝基喹啉-1-氧化物(4-NQ0)或苯并[a]芘為陽性參照物，制備含有不同濃度陽性參照物的標準稀釋溶解暴露處理實驗用魚，以不含陽性參照物的人工配制稀釋水為空白對照組；采用酶聯免疫(ELISA)試劑盒檢測實驗用魚體內8-OHdG濃度；以陽性參照物暴露處理組/空白對照組的8-OHdG濃度比值為縱坐標，以陽性參照物暴露濃度為橫坐標，制作標準曲線；
[0015]第五步、毒性評價:計算受試水樣暴露處理組與空白對照組(不含陽性參照物的人工配制稀釋水)的8-OHdG濃度比值，然后用標準曲線方程計算受試水樣遺傳毒性的
4-NQ0或苯并[a]芘當量值；受試水樣的遺傳毒性效應以4-NQ0或苯并[a]芘當量值進行定量評價。
[0016]進一步地，所述的檢測污染水體遺傳毒性的生物學方法:
[0017]以DNA氧化損傷標志物8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)為標志物，評價污染水體的遺傳毒性效應。
[0018]進一步地，所述的檢測污染水體遺傳毒性的生物學方法:
[0019]在第一步馴養試驗中，試驗用水是經24小時曝氣除氯且經活性炭吸附處理的自來水或人工配制稀釋水，水質硬度在10mg/L-250mg/L(以CaCO3為計)，PH在6.0-8.5之間，溶解氧不低于空氣飽和值的60%。
[0020]進一步地，所述的檢測污染水體遺傳毒性的生物學方法:
[0021]第二步暴露試驗中，污染水體可是城市污水、工業廢水、地表水、地下水或其他污染水體。
[0022]進一步地，所述的檢測污染水體遺傳毒性的生物學方法:
[0023]第三步8-OHdG檢測中，檢測方法可用酶聯免疫(ELISA)試劑盒或色譜法。
[0024]進一步地，所述的檢測污染水體遺傳毒性的生物學方法:
[0025]第三步8-OHdG檢測中，可檢測全魚或部分器官組織中的8-OHdG含量。
[0026]進一步地，所述的檢測污染水體遺傳毒性的生物學方法:
[0027]第四步標準曲線制作中，以4-硝基喹啉-1-氧化物(4-NQ0)或苯并[a]芘為陽性參照物。
[0028]進一步地，所述的檢測污染水體遺傳毒性的生物學方法:
[0029]第四步標準曲線制作中，以陽性參照物暴露處理組/空白對照組的8-OHdG濃度比值為縱坐標，以陽性參照物暴露濃度為橫坐標，制作標準曲線。
[0030]進一步地，所述的檢測污染水體遺傳毒性的生物學方法:第五步毒性評價中，用標準曲線方程計算受試水樣遺傳毒性的4-NQ0或苯并[a]芘當量值。
[0031]進一步地，所述的檢測污染水體遺傳毒性的生物學方法:第五步毒性評價中，以的4-NQ0或苯并[a]芘當量值定量評價受試水樣的遺傳毒性效應大小。
[0032]3.有益效果
[0033]基于DNA氧化損傷是外源性污染物導致生物體遺傳毒性的最常見生物學機制，本發明以DNA氧化損傷產物8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)為標志物，檢測污染水體對魚類體內的DNA氧化損傷程度，并以4-硝基喹啉-1-氧化物(4-NQ0)或苯并[a]芘為陽性參照物，定量評價污染水體的遺傳毒性效應。該方法可綜合評價污染水體對生物的遺傳毒性效應，具有操作簡單、實驗周期短、反應靈敏、重現性好等優點，非常適用于各種類型污染水體的遺傳毒性定量評價，將在水質監測工作中有廣闊的應用前景。
【具體實施方式】
[0034]以下結合實施例進一步說明本發明
[0035]實施例1:某城市污水處理廠二沉池排水的遺傳毒性效應評價
[0036]第一步、馴養試驗:選擇體長為4-5cm之間的健康鯉魚，放在經24小時曝氣除氯且經活性炭吸附處理的自來水中馴養7天，馴養期間保證鯉魚的死亡率低于5%，如果高于5%,則換一批鯉魚重新馴養。
[0037]第二步、暴露試驗:在3個裝有1L某城市污水處理廠二沉池排水水樣和I個裝有1L處理后自來水樣的玻璃燒杯中分別放入10尾鯉魚進行暴露試驗，暴露時間為10天。
[0038]第三步、8-OHdG檢測:取鯉魚的肝臟放置燒杯中，然后用勻漿機進行充分勻漿。勻漿液轉入離心管，在5000rpm條件下離心10分鐘后取上清液，用酶聯免疫(ELISA)試劑盒檢測上清液中的8-OHdG濃度，計算魚體8-OHdG濃度。
[0039]第四步、標準曲線制作:以4-硝基喹啉-1-氧化物(4-NQ0)為陽性參照物，以二甲基亞砜(DMSO)為助溶劑，配制成濃度分別0.5 μ g/L、l μ g/L、5 μ g/L、10 μ g/L、20 μ g/L、50 μ g/LUOO μ g/L的4-NQO水溶液進行鯉魚的半靜態暴露試驗，以不加4-NQ0的二甲基亞砜空白溶液為對照組，暴露時間為10天。采用用酶聯免疫(ELISA)試劑盒檢測鯉魚肝臟體內8-OHdG濃度，以4-NQ0暴露處理組/對照組的8-OHdG濃度比值為縱坐標，以4-NQ0暴露濃度為橫坐標，得到標準曲線方程是y = 0.0165X+1.3744 (R2 = 0.95)。
[0040]第五步、毒性評價:計算某城市污水處理廠二沉池排水暴露處理組與空白對照組的8-OHdG濃度比值是1.72，然后用標準曲線方程計算出二沉池排水的4-NQ0當量值為14.3 μ g/Lo
[0041]實施例2:某制藥廠排水的遺傳毒性效應評價
[0042]第一步、馴養試驗:選擇體長為2-3cm之間的健康斑馬魚，放入人工配制稀釋水中馴養12天，馴養期間保證斑馬魚的死亡率低于5%，如果高于5%，則換一批斑馬魚重新馴養。
[0043]第二步、暴露試驗:在3個裝有某制藥廠排水水樣和I個裝有8L人工配制稀釋水的玻璃燒杯中分別放入15尾斑馬魚進行暴露試驗，暴露時間為7天。
[0044]第三步、8-OHdG檢測:取斑馬魚的全魚放置燒杯中，然后用勻漿機進行充分勻漿。勻漿液轉入離心管，在5000rpm條件下離心10分鐘后取上清液，用酶聯免疫(ELISA)試劑盒檢測上清液中的8-OHdG濃度，計算魚體8-OHdG濃度。
[0045]第四步、標準曲線制作:以4-硝基喹啉-1-氧化物(4-NQ0)為陽性參照物，以二甲基亞砜(DMSO)為助溶劑，配制成濃度分別0.5 μ g/L、l μ g/L,5 μ g/L、10 μ g/L,20 μ g/L、50 μ g/LUOO μ g/L的4