一種測定龍葵中總生物堿含量的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于中藥質量控制領域，設及一種龍葵中總生物堿的含量測定方法。
【背景技術】
[0002] 龍葵為茄科植物龍葵Solanumnigrum的干燥地上部分，性寒，味苦，微甘，有小毒， 歸肺、胃二經，有清熱解毒、消腫散結、消炎利尿的功效。龍葵的藥理活性成分主要為生物堿 類，包括龍葵堿、澳洲茄邊堿、澳洲茄堿、澳洲茄明堿、茄微堿等。少數文獻報道了龍葵藥材 及制劑的含量測定方法，均W澳洲茄堿、澳洲茄邊堿為對照品，采用高效液相色譜法或與質 譜聯用進行測定。該方法對單體化合物的含量測定靈敏準確，但用于總生物堿含量測定時 操作技術要求高，較為繁瑣，儀器維持和使用費用較高，試劑成本耗費較大，同時HPLC測定 含量時流動相的選擇、加入的憐酸溶液等對峰形、保留時間等仍有一定影響。不同地區不同 部位的龍葵藥材中澳洲茄堿、澳洲茄邊堿含量差異較大，現代藥理研究顯示龍葵多種醬體 生物堿在體內外均具有較好的抗腫瘤活性，因此W龍葵總生物堿的含量作為藥材檢測指標 更合理。本實驗通過酸性染料比色法W紫外分光光度計測定龍葵中總生物堿含量的方法， 操作簡便，成本低廉，精密度好、回收率高，重現性好，可作為龍葵藥材質量評價的指標，W 克服現有技術的不足。
【發明內容】
[0003] 為了解決現有技術中的上述問題，本發明提供了一種龍葵總生物堿含量檢測方 法，操作簡便，成本低廉，精密度好、回收率高，重現性好，可作為龍葵藥材質量評價的指標。
[0004] 1、一種測定龍葵中總生物堿含量的方法，其特征在于包括W下步驟： 陽0化](1)對照品溶液的制備：精密稱取干燥至恒重的龍葵堿對照品5.OOmg，用氯仿溶 解，超聲20min，轉移至50血容量瓶，加氯仿稀釋至刻度，搖勻即得0.Img/mL的對照品儲備 液；
[0006] (2)標準曲線的制作：精密吸取對照品儲備液于5ml量瓶中用氯仿稀釋配成梯度 的標準溶液，精密吸取2ml標準溶液置于分液漏斗中，加入酸性緩沖溶液及漠甲酪綠染料 溶液進行顯色，再加入氯仿萃取，分取氯仿層脫水處理，取上清液按照紫外分光光度法，于 243nm處測定吸光度；W氯仿W相同試劑及步驟處理做空白對照；W龍葵堿含量為橫坐標， W其吸光度值為縱坐標，得龍葵總生物堿含量測定標準曲線；
[0007] (3)供試品溶液的制備：精密稱取已過14目篩的龍葵藥材粉末2.Og，置于錐形瓶， 加入體積比為1 : 4的2mol/L鹽酸和90%乙醇混合溶劑30血，于40°C下超聲提取35min， 提取液減壓回收乙醇至無醇味的浸膏，浸膏用10%鹽酸溶解，超聲20min助溶，抽濾去除沉 淀，用10%鹽酸定容至10血，用10%化0H調節抑至10-11，加氯仿萃取3次，收集氯仿液， 定容至25ml，即得供試品溶液；
[000引 （4)樣品溶液的含量測定：精密吸取供試品溶液2.OmL，按照步驟似中所述，加入 酸性緩沖溶液及漠甲酪綠染料溶液進行顯色，再加入氯仿萃取，分取氯仿層脫水處理，取上 清液按照紫外分光光度法，于243nm處測定吸光度，代入標準曲線，計算得到龍葵總生物堿 的含量。
[0009] 進一步地，步驟（2)和（4)中酸性緩沖溶液為抑=3. 6的醋酸-醋酸鋼緩沖溶液， 加入量為3. 5ml。
[0010] 步驟似和（4)中漠甲酪綠染料溶液，加入量為2ml。
[0011] 步驟（2)和（4)中氯仿萃取及脫水處理要求為，用10ml氯仿分=次萃取，分別是 4血、3血、3血，密塞劇烈振搖5min后，靜置30min，取氯仿層用干燥定量濾紙過濾，加入干燥 具塞并已加入0. 25g無水硫酸鋼的=角燒瓶中靜置30min后，分取上清液。
[0012] 本發明W龍葵堿制備對照品溶液，將龍葵藥材制備成供試品溶液，在酸性緩沖溶 液中利用漠甲酪綠染料與生物堿結合成有色絡合物并W氯仿萃取，采用紫外分光光度計在 一定波長處測定該有色溶液的吸收度，用W計算生物堿的含量。
[0013] 為使本領域技術人員更好的理解本發明，本申請人進行了一系列實驗研究，W證 明本發明的效果：
[0014] 1 試藥
[0015] 龍葵飲片，購自浙江嘉信醫藥有限公司，經鑒別符合2010年版中國藥典（一部）。 龍葵堿對照品，購自陜西慈緣生物技術有限公司，批號20131223。漠甲酪綠、氯仿、乙醇、醋 酸、醋酸鋼、無水硫酸鋼等，購自嘉興市甫宏化工有限公司，均為分析純。
[0016] 2儀器
[0017]UV2201型紫外可見分光光度計（日本島津），BS224S型電子分析天平（北京賽多 利斯），BGZ246型數顯電熱恒溫干燥箱（上海博訊），L冊8A型連續投料粉碎機（新昌彰誠機 械），RE5299型旋轉蒸發儀（上海亞榮）、HH4型數顯電熱恒溫水浴鍋（常州國華）、GM0. 5B 型隔膜式真空累（天津津騰）、LX920S1型電動吸引器（上海斯曼峰）、KQ300DE型數顯溫控 超聲清洗儀（昆山舒美）。 陽〇1引 3溶液的配制
[0019] 3. 1緩沖溶液先配制0.2mol/L的醋酸溶液和醋酸鋼溶液。A液：量取醋酸 11. 55111以加蒸饋水稀釋至lOOOmU冷藏保存。B液：稱取16. 4g醋酸鋼或27. 22g含水醋酸 鋼，加蒸饋水溶解，稀釋定容至lOOOmU冷藏保存。再依下表分別配制不同抑值的緩沖液： A液X血+B液y血，加水稀釋至100血，最后經抑計校正。
[0021] 3. 2染料溶液0.05%漠甲酪綠溶液：精密稱取0.Ig，溶于0.05mol/L氨氧化鋼溶 液2. 8血，用水稀釋至200血，搖勻即得。
[0022] 3. 3對照品溶液精密稱取干燥至恒重的龍葵堿對照品5.OOmg，用氯仿溶解，超聲 20min，轉移至50血容量瓶，加氯仿稀釋至刻度，搖勻即得0.Img/mL的對照品儲備溶液。
[0023] 3.4供試品溶液龍葵飲片60°C干燥，粉碎過14目篩。精密稱取龍葵藥材粉末 2.Og，置于錐形瓶，加入2mol/L鹽酸：90 %乙醇（體積比1 : 4)的混合溶劑30血，于 40°C下超聲提取35min，提取液減壓回收乙醇至無醇味的浸膏，浸膏用10%鹽酸溶解，超聲 20min助溶，抽濾去除沉淀，用10%鹽酸定容至10血，用10%化0H調節抑至10-11，加氯仿 萃取3次，收集氯仿液，定容至25ml，即得供試品溶液。
[0024] 4測定波長的選擇
[0025] 精密吸取龍葵堿對照品溶液與龍葵供試品溶液各分別置于分液漏斗中，分別 精密加入抑3. 6的醋酸-醋酸鋼緩沖溶液3. 5mU及漠甲酪綠染料再加入氯仿lOmL 分3次萃取（4, 3, 3mL)，密塞劇烈振搖5min后，靜置30min，分取氯仿層，用干燥定量濾紙過 濾，加入干燥具塞=角燒瓶中（已加入0. 25g無水硫酸鋼）靜置30min后，取上清液在紫外 分光光度計于200-700nm范圍內分別掃描。另精密吸取氯仿置于分液漏斗同上操作， 所得氯仿液為空白對照液。結果表明，龍葵堿對照品溶液和龍葵供試品溶液均在243nm處 有最大吸收峰，而空白對照液在該處無吸收峰，故選擇243nm為測定波長。 陽0%] 5酸性染料比色法的建立
[0027] 5. 1緩沖液抑的考察精密吸取龍葵堿對照品溶液2. 0血共5份于分液漏斗中， 分別加入抑值為3. 6、4. 0、4. 4、4. 8、5. 2的醋酸-醋酸鋼緩沖液，其余操作同上，所得測定 液分別于243nm處測定吸光度。結果表明緩沖液抑值為3. 6時，測定液有最大吸光度。精 密吸取供試品溶液2.OmL同法操作，結果與對照品所測一致。
[0028] 5.2緩沖液用量的考察精密吸取龍葵堿對照品溶液2.0血共5份于分液漏斗中， 分別加入抑值3. 6的緩沖液1. 0,1. 5, 2. 0, 2. 5, 3.OmU其余操作同上，所得測定液分別于 243nm處測定吸光度。結果表明緩沖液用量為3. 5mL時吸光度最大。精密吸取供試品溶液 2. OmL同法操作，結果與對照品所測一致。
[0029] 5. 3酸性染料用量的考察精密吸取龍葵堿對照品溶液2.OmL共5份于分液漏 斗中，分別加入抑3. 6的緩沖液3. 5mU分別加入漠甲酪綠染料溶液1. 0,1. 5,2. 0,2. 5， 3. OmU其余操作同上，所得測定液分別于243nm處測定吸光度。結果表明酸性染料用量為 2mL時吸光度最大。精密吸取供試品溶液2.OmL同法操作，結果與對照品所測一致。
[0030] 5. 4顯色穩定性的考察精密吸取龍葵對照品溶液2. 0血共10份于分液漏斗中， 按照實施例2第1項方法操作，分別在顯色后的10, 20, 30,40, 50,60, 70,80,90,lOOmin時， 測定吸收度。結果表明在顯色后30min后吸收度無明顯變化。
[0031] 6酸性染料比色法測定龍葵中總生物堿含量的方法學考察
[0032] 6. 1精密度的考察精密吸取龍葵堿對照品溶液2.OmU按4項下方法操作測定， 連續測定6次，結果測得吸收值的RSD= 0. 49%，表明儀器精密度良好。
[0033] 6. 2穩定性的考察精密吸取龍葵堿對照品溶液2.OmU按4項下方法操作測定， 每隔30min測1次吸收值，共測5次，結果顯示化內吸收值RSD=0. 8%，說明樣品液在化 內穩定性好。
[0034] 6. 3線性關系的考察精密吸取對照品溶液0. 5,1. 0,1. 5, 2. 0, 2. 5, 3. 0血于5ml 量瓶中用氯仿稀釋配成梯度的標準溶液，分別精密吸取2ml置于分液漏斗中，按4項下方法 操作，測定液在243nm測定吸光度。W龍葵堿含量為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲 線，計算回歸方程為Y= 0. 0129X-0. 0087，r2= 0. 9960,線性范圍為5-30yg/mL。見圖1。
[0035] 6. 4重復性試驗精密稱取同批號的龍葵干燥粉末5.Og，按4項下方法平行制備6 份供試品溶液，各精密取2.OmU按照實施例2第1項方法操作測定吸光度，結果顯示RSD= 1. 53%。
[0036] 6. 5加樣回收率實驗精密吸取已測定含量的龍葵堿供試品溶液2.OmL各6份，加 入已知濃度的龍葵堿對照品溶液2.OmU按4項下方法操作測定吸光度，根據回歸方程，計 算龍葵堿含量，并按下式計算回收率。結果顯示平均回收率為99.7%，RSD= 1.4%。
[0037] 加樣回收率（％ )=(測得量一供試品含量）/對照品含量X100%
[0038] 表1回收率試驗結果（n=6)
[0041] 本發明的酸性染料比色法測定龍葵中總生物堿含量，是根據在適當介質中，堿性 藥物度）可