用于富集和分離具有的濃度在若干對數級上的細胞的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及磁性的流式細胞術。
【背景技術】
[0002]在用于流式細胞術的目前已知方法中，借助于通道中的額外的液體流來使細胞集中在主通道的中心中并且因此被分離(鞘流原理)。此分離使得有可能在后續測量步驟中計數細胞(例如通過光學或阻抗滴定裝置)。通過磁性標記待定量的顆粒，有可能在實際定量之前從復雜樣本中分離和富集所述顆粒。
[0003]然而，為了維持此技術的功能性，需要產生鞘流的大量的額外液體。此方法還與具有例如稀釋步驟和離心步驟的進一步制備相關，這些制備也與污染風險相關。稀釋步驟對于使計數率與細胞計數器的(即計數器的)磁傳感器的最小和最大計數率匹配而言是必要的。
[0004]待實現的目標在于提供一種裝置和一種方法，通過所述裝置和所述方法能夠更快速地且以更小的污染風險進行細胞術測量，例如，確定細胞樣本的濃度。
【發明內容】
[0005]此目標通過根據本申請權利要求1的根據本發明用于流式細胞術測量的裝置來實現。此外，所述目標通過根據申請權利要求10的根據本發明的方法來實現。本發明的有利改進由從屬權利要求詳細說明。
[0006]本發明是基于在閉合系統內進行多個富集步驟的概念。這通過根據本發明的裝置的通道的結構設計和通過使用所述通道中的偏轉裝置而變得可能的。本發明使能進行具有多于10的數次冪的濃度(例如10至10000個細胞/微升)的細胞的靶向富集和分離。特別地，本發明使得有可能能夠在單個測量過程中測量可能的多于10的多次冪的細胞濃度。即使在計數器的受限制的動態響應的情況下，這也允許在復雜樣本內的單個微流體通道中覆蓋較大的動態范圍，而無需先前稀釋、分離或富集步驟。
[0007]為此目的，根據本發明的用于流式細胞術測量的裝置包括室和通道，其中所述通道包括磁傳感器并且設置在所述室的下游。所述室和所述通道形成閉合系統，其中所通道的軸線沿著所述通道的流動方向延伸。如果所述室直接匯合至所述通道中，則存在閉合系統。所述裝置特征在于磁體，更具體地在于永磁體和偏轉裝置，所述磁體和所述偏轉裝置兩者均布置在所述通道的預定側處。在此，所述偏轉裝置具有至少一個區段。每個區段布置在通道的濃度區域中。每個區段具有用于引導細胞朝向軸線的裝置。偏轉裝置由此能夠實現磁性標記細胞的富集，所述細胞通過各個濃度區域中的磁體被拉至通道的一側，至所述軸線上且這些細胞沿著所述軸線被引導至磁傳感器。
[0008]以上論述的目標同樣由根據本發明的用于富集對于流式細胞術的細胞樣本中待檢測的細胞類型的細胞的方法來實現。在此首先提供待檢測的細胞類型的磁性標記細胞。標記細胞被富集在根據本發明的裝置的實施例的通道中。為此目的，標記細胞借助于通道中的磁體被拉至所述通道的預定側上。在通道中的層流的情況下，那里的細胞中的至少一些通過偏轉裝置被引導至軸線，所述軸線沿所述通道的流動方向延伸，并且由此富集在所述軸線上。這使能實現細胞的有效富集。因此，即使復雜樣本(即含有許多不同細胞和其它顆粒(例如蛋白質)的未純化樣本)也能夠用于無中間步驟的流式細胞術，特別是以未稀釋的方式。
[0009]提供磁性標記細胞能夠包括標記所述細胞。在此，可使用兩種標記變型。
[0010]在第一種變型中，待檢測的細胞可在培養步驟中通過在裝置的室中混合和/或攪拌標記物(具體地，對于待檢測的細胞類型具有特異性的至少一種抗體，所述抗體連接至至少一種磁性標記物)和細胞樣本來進行標記。此變型優選地在達14個細胞/微升的較小總細胞濃度的情況下使用。在這種情況下，布置在所述室的側上的磁體能夠有助于混合和/或攪拌過程。
[0011]在所述裝置的一個實施例中，磁體對應地布置在所述室的預定側處，所述磁體有助于混合和/或攪拌過程。
[0012]在具有更大總細胞濃度(例如達16個細胞/微升)的細胞樣本的情況下，可替代地，有可能在通道中提供在制備期間對于待檢測的細胞類型具有特異性的至少一種抗體，所述抗體與至少一種磁性標記物相連接。當使用布置在通道的一側上的磁體在所述通道中產生磁場時，抗體在所述通道的所述側處富集。緊接著，細胞樣本被引入至通道中，且由此使至少一種特異性抗體與細胞樣本的以層流方式流經所述通道的所述側的那一部分相接觸。因此，在此部分中包含細胞的部分標記，而無需稀釋或純化步驟。因此，在層流系統中實現所需細胞的逐層標記。可替代地，還能夠借助于設置在那里的磁體在室中進行此類部分標記。
[0013]因此，在流體流的情況下，僅一層(即細胞樣本的限定部分，例如所需細胞的1%)在閉合系統中被磁性標記。
[0014]偏轉裝置能夠具有一個或多個導向元件，其作為用于引導區段中的細胞的裝置，所述導向元件例如形成凹槽并且將標記細胞引導至軸線。在根據本發明的裝置的尤其有利的實施例中，偏轉裝置的至少一個區段包括布置成與軸線成角度的導向元件，其作為用于引導細胞的裝置。以一起或獨立的方式，所述導向元件形成在流動方向上漸縮的至少一個漏斗形狀。這使磁性標記細胞能偏轉至通道的軸線，且由此使能實現富集。
[0015]以示例的方式，如果它完全或部分地包括鐵磁性材料，則在裝置的另一實施例中至少一個導向元件能夠形成在流動方向上漸縮的V形，從而促進磁性標記細胞的磁泳導向。
[0016]額外地或者可替代地，所述導向元件中的至少兩個能夠配置成對于多個細胞的壁并且能夠布置成在流動方向上沿軸線偏置，且由此形成朝向所述軸線的機械引導，這是憑借形成對于細胞的運動路徑的邊界來實現的。
[0017]額外地，磁性腹板能夠沿通道的軸線布置，特別地設置在相同軸線水平處的兩個導向元件之間。因此，促進在通道的軸線上的磁性標記細胞的引導。
[0018]優選地，通道的至少兩個濃度區域具有不同的構型。細胞樣本能夠由此在多個對數級中富集。這樣能夠實現的是能夠通過具有受限制的動態響應的計數器來測量存在的富集。
[0019]以示例的方式，所述至少兩個濃度區域能夠在預定側與同所述預定側相對的一側之間的通道的預定高度方面有所不同。因此，在每個濃度區域中確定限定體積。不同濃度區域中的不同體積引起在偏轉元件中在富集之前通過通道的磁體進行細胞的第一富集，使得統計學上有意義的和限定的細胞數量在給定濃度下的每個富集步驟中是可調整的。
[0020]相比之下，通道寬度優選地對于所有濃度區域是恒定的。在恒定通道寬度的情況下，額外地或可替代地，所述至少兩個濃度區域能夠在偏轉裝置的預定寬度(如垂直于軸線所測量的)和/或所述偏轉裝置沿通道的軸線的各個區段的長度方面有所不同。這些尺寸確定偏轉裝置的匯流面積，即影響富集的程度。
[0021]在根據本發明的方法的一個實施例中，借助于磁傳感器在偏轉裝置下游的軸線上進行細胞術，具體地細胞計數。使用這樣，有可能例如確定細胞樣本的濃度。
[0022]在這種情況下，借助于偏轉裝置下游的細胞術確定細胞樣本的濃度優選地包括借助于磁傳感器對來自至少一個濃度區域且流經軸線上的富集的細胞進行計數。針對至少一個濃度區域，從在計數富集的細胞時確立的濃度區域的計數值、濃度區域的體積以及濃度區域中的偏轉裝置的區段的寬度來確立細胞樣本的濃度。這是有效和節省時間的測量，其的評估是快速可用的。自然地，在此選擇至少濃度區域，針對所述濃度區域出現對于統計學相關陳述而言足夠大并且小于由計數器能夠可靠記錄的最大計數率的計數器值。
[0023]可能需要確立在給定時間當前計數的細胞所屬的濃度區域。在所述方法的另一實施例中，針對其確立計數器值的各個濃度區域是基于磁傳感器的計數過程的已確立的時間來確立的。因此有可能引起時間間隔分配至校準裝置中的濃度區域。在某些情況下應考慮流速。
【附圖說明】
[0024]下面，將基于附圖以具體的示例性實施例再一次更詳細地解釋本發明。在附圖中:
圖1示出根據本發明的裝置的實施例在截面中的簡圖，
圖2示出根據本發明的裝置的通道的簡圖，其中圖1A示出示意性的截面，且圖1B示出通道的示意性頂視圖，
圖3示出偏轉裝置的不同實施例的簡圖，其中圖3A示出具有機械導向件的偏轉裝置的透視圖，并且圖3B和圖3C示出具有磁泳導向件的偏轉裝置在每種情況下的示意性頂視圖，圖4示出在根據本發明的方法的實施例中緊接著引入細胞樣本之后(圖4A)和施加磁場之后(圖4B)通道中的細胞樣本的簡圖，
圖5示出闡明在根據本發明的方法的實施例中通道中的細胞的富集的簡圖，其中圖5A示出在一個時間點通道的頂視圖，且圖5B示出在不同時間偏轉裝置的區段的頂視圖，以及圖6示出其中在根據本發明的方法的實施例中測定細胞濃度以及在不同時間的通道的四個部段的簡圖。
【具體實施方式】
[0025]以下更詳細解釋的示例性實施例代表本發明的優選實施例。在圖中，功能上等效的元件具有相同的附圖標記。圖中的坐標系K和K’幫助定向，其中豎直軸線“z”和與其垂直的水平軸線“X”簡化截面中的取向(圖1A)，并且其中水平軸線“X”和與水平軸線“X”和豎直軸線“z”垂直的軸線“y”簡化示例性通道14的頂視圖