一種肺纖維化早期診斷標志物篩查體系及聯合檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種肺纖維化診斷標志物篩查體系，具體涉及一種肺纖維化早期診斷標志物篩查體系及聯合檢測試劑盒，屬于醫療技術領域。
【背景技術】
[0002]近年來，肺纖維化的發病率和死亡率呈不斷增長趨勢，因此，早期診斷和治療對于改善預后具有重要意義。而肺纖維化在早期階段依據臨床表現、影像學特征及一些有創檢查，難以做到早期診斷并評價肺泡-毛細血管屏障損傷程度，現無可靠的標志物作為其早期診斷的指標，單一標志物無法評定其診斷、預后和轉歸，因此，建立肺纖維化病例標本數據庫和標志物篩查體系，開發一種高通量、多樣本、高特異性和敏感性的生物檢測技術，具有極其重要的臨床應用價值，為此，我們提出一種肺纖維化早期診斷標志物篩查體系及聯合檢測試劑盒。
【發明內容】
[0003]本發明要解決的技術問題克服現有的缺陷，提供一種肺纖維化早期診斷標志物篩查體系及聯合檢測試劑盒，本發明具有高通量、多樣本、高特異性和敏感性的生物檢測技術，具有極其重要的臨床應用價值，可以有效解決【背景技術】中的問題。
[0004]為了解決上述技術問題，本發明提供了如下的技術方案:
[0005]本發明提供一種肺纖維化早期診斷標志物篩查體系及聯合檢測試劑盒，所述肺纖維化具體診斷方法:
[0006]1.病人數據庫及血液樣本庫的建立:
[0007]在多家醫院尤其是三級甲等醫院以及全國肺纖維化多中心研究醫院收集彌漫性間質性肺疾病病人血液樣本，建立血液樣本庫，并根據臨床資料進行分類管理。同時，收集所有研究對象詳細的一般人口特征、影像學和病理學資料，建立系統詳實的資料數據庫。為了驗證肺纖維化患者生物標志物的特異性和敏感性，我們將募集肺纖維化病人及正常健康人(吸煙和不吸煙者)、支氣管哮喘病人和coro病人，具體分組如下:
[0008](1)彌漫性間質性肺疾病組(ILD組):募集100例彌漫性間質性肺疾病病人，其中特發性肺間質纖維化組(IPF組)病人50例，風濕系統疾病相關的肺纖維化(CTD組)病人30例，其他病人組(包括外源性過敏性肺泡炎、肺血管炎、及其他病理類型的特發性間質性肺炎)20例。
[0009](2)正常對照組:健康吸煙組和健康不吸煙組各20例。
[0010](3)支氣管哮喘對照組病人20例。
[0011](4)C0PD對照組病人20例。
[0012]2.肺纖維化標志物的篩查及其單克隆抗體的制備
[0013](1)肺纖維化標志物的篩查及體系的建立
[0014]應用RT-PCR和Western blot分別檢測4種不同細胞來源的主要生物標志物SP-A、SP-D、KL-6、TGF-β、TNF-α、IL-8、IL-13、IL2 2、ET-1、MMP7、NAPSIΝΑ、CCL18、YKL40、CCN2、VEGF在肺纖維化病人及健康者、健康吸煙者、哮喘患者、慢阻肺病人的基因和蛋白質表達水平，并結合影像學和病理學特征，篩選出相對可靠和穩定的敏感和特異性因子作為標志物、并排除其他疾病可能出現的干擾因素。
[0015]應用現有ELISA技術對所篩查的特異標志物進行含量測定，再根據肺纖維化的程度、病因進行歸類和分組。
[0016](2)生物標志物單克隆抗體的制備:購買所篩選出的肺纖維化生物標志物蛋白質作為抗原，采用雜交瘤技術在小鼠體內制備其單克隆抗體，并進行純化，ELISA法檢測其抗體效價，對其抗原性、免疫原性、親和性進行驗證。
[0017]3.制備肺纖維化標志物蛋白抗體芯片檢測系統:
[0018](1)芯片的選擇:選用載玻片作為片基，將載玻片硅烷化。
[0019](2)抗體芯片的制備:將上述生物標志物的單克隆抗體通過點陣法在載玻片上進行點樣，制備好的芯片放入濕盒中，4°C過夜。準備用于下一步血清樣本的檢測。
[0020]4.抗體芯片檢測血清樣本:
[0021 ] (1)血清樣本的標記:將血清樣本進行生物素標記，備用。
[0022](2)抗體芯片檢測血清樣本:將制備好的抗體芯片于室溫下封閉1小時，洗滌后將血清樣本加樣于芯片上，加熒光染料孵育后洗滌，用熒光芯片掃描儀進行信號檢測。所得檢測數據采用分析軟件進行分析與校正。
[0023]5.抗體芯片制備的條件優化:
[0024]在整個芯片制備過程中，通過對點樣方式、點樣濃度、封閉劑的種類、封閉時間、樣品生物素標記試劑與血清蛋白的比例以及血清樣本最終檢測所用的分析濃度等條件一一進行優化。
[0025]6.統計學分析:
[0026]將肺纖維化生物標志物蛋白芯片檢測結果應用SPSS統計軟件進行統計學分析，并與傳統ELISA法測得數據進行統計學比較，觀察其特異性和敏感性。
[0027]7.制定隨訪調查表:
[0028]對入組肺纖維化樣例進行長期跟蹤隨訪，每隔2個月檢測一次肺纖維化生物標志物，觀察指標的變化與疾病進展、治療效果及預后的關系。
[0029]本發明所達到的有益效果是:一種肺纖維化早期診斷標志物篩查體系及聯合檢測試劑盒，由于采用了該檢測技術:1.病人數據庫及血液樣本庫的建立;2.肺纖維化標志物的篩查及其單克隆抗體的制備;3.制備肺纖維化標志物蛋白抗體芯片檢測系統;4.抗體芯片檢測血清樣本;5.抗體芯片制備的條件優化;6.統計學分析;7.制定隨訪調查表，能夠做到早期診斷并評價肺泡-毛細血管屏障損傷程度，避免病情惡化。
【具體實施方式】
[0030]以下結合實施例對本發明的優選實施例進行說明，應當理解，此處所描述的優選實施例僅用于說明和解釋本發明，并不用于限定本發明。
[0031]實施例:本發明一種肺纖維化早期診斷標志物篩查體系及聯合檢測試劑盒，所述肺纖維化具體診斷方法:
[0032]1.病人數據庫及血液樣本庫的建立:
[0033]在多家醫院尤其是三級甲等醫院以及全國肺纖維化多中心研究醫院收集彌漫性間質性肺疾病病人血液樣本，建立血液樣本庫，并根據臨床資料進行分類管理。同時，收集所有研究對象詳細的一般人口特征、影像學和病理學資料，建立系統詳實的資料數據庫。為了驗證肺纖維化患者生物標志物的特異性和敏感性，我們將募集肺纖維化病人及正常健康人(吸煙和不吸煙者)、支氣管哮喘病人和coro病人，具體分組如下:
[0034](1)彌漫性間質性肺疾病組(ILD組):募集100例彌漫性間質性肺疾病病人，其中特發性肺間質纖維化組(IPF組)病人50例，風濕系統疾病相關的肺纖維化(CTD組)病人30例，其他病人組(包括外源性過敏性肺泡炎、肺血管炎、及其他病理類型的特發性間質性肺炎)20例。
[0035](2)正常對照組:健康吸煙組和健康不吸煙組各20例。
[0036](3)支氣管哮喘對照組病人20例。
[0037](4)C0PD對照組病人20例。
[0038]2.肺纖維化標志物的篩查及其單克隆抗體的制備
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