芯片式高通量生物檢測冷凍均勻進樣方法
【專利摘要】一種芯片式高通量生物檢測冷凍均勻進樣方法，包括如下步驟：步驟1：將待測溶液充分攪拌均勻；步驟2：將攪拌混勻的待測液體置于與芯片匹配的容器中；步驟3：冷凍待測液體，獲得固態冰片；步驟4：將固態冰片置于芯片上方，融化后實現液體均勻進入到芯片上的微型孔中。本發明人工參與少，不依賴復雜設備與平臺，進樣準確，效率高，均勻性好，尤其適用于數字化PCR檢測等要求單模板的高通量微反應體系。
【專利說明】
芯片式高通量生物檢測冷凍均勻進樣方法
技術領域
[0001]本發明涉及芯片式高通量生物檢測方法中樣品導入領域，尤其涉及一種芯片式高通量生物檢測冷凍均勻進樣方法。
【背景技術】
[0002]在高通量生物檢測中，將待檢測物質均勻導入反應位點是整個檢測的第一步。待檢測物進入芯片微孔是否均一，占孔率的高低，單模板占孔數的多少，對于芯片的利用率、檢測試驗的成功率、檢測結果的有效性都十分重要。
[0003]目前的進樣方法主要包括手動刮液，微流控以及液滴噴打幾種方式。各自的思路分別為:
[0004]手動刮液式:將液體滴注到芯片表面，用玻片刮勻，使溶液在玻片的壓力之下逐步進入微孔。
[0005]微流控:通過設計帶有微流控功能的芯片，通過外部壓力及溝道導引使溶液進入芯片微孔。
[0006]液滴噴打:通過精細的微動平臺及高精度噴頭，精準生成微升級的液滴并噴打至芯片微孔。
[0007]現有幾種方法分別存在以下問題:首先，手動刮液式進樣方法對操作人員要求高，需要十分嚴謹的訓練以及高度專注，同時難以保證進液效果，芯片污染乃至實驗失敗的風險高;其次，微流控芯片導流進樣的方式會明顯增加測試芯片的成本，且同樣面臨液體流動不暢導致實驗效果被削弱的風險;最后，對于高精度液滴噴打的方式，需要依賴昂貴復雜的液體打印平臺，難以在實際檢測中廣泛實施。
【發明內容】
[0008]本發明鑒于上述情況而做出，其目的是提供一種芯片式高通量生物檢測冷凍均勻進樣方法，該方法只需要簡單的操作、利用自然的物理相變過程，準確有效地實現芯片微孔均勻進樣。人工參與少，不依賴復雜設備與平臺，進樣準確，效率高，均勻性好，尤其適用于數字化PCR檢測等要求單模板的高通量微反應體系。
[0009]本發明提供一種一種芯片式高通量生物檢測冷凍均勻進樣方法，包括如下步驟:
[0010]步驟1:將待測溶液充分攪拌均勻；
[0011]步驟2:將攪拌混勻的待測液體置于與芯片匹配的容器中；
[0012]步驟3:冷凍待測液體，獲得固態冰片；
[0013]步驟4:將固態冰片置于芯片上方，融化后實現液體均勻進入到芯片上的微型孔中。
[0014]本發明的有益效果是，該方法只需要簡單的操作、利用自然的物理相變過程，準確有效地實現芯片微孔均勻進樣。人工參與少，不依賴復雜設備與平臺，進樣準確，效率高，均勻性好，尤其適用于數字化PCR檢測等要求單模板的高通量微反應體系。
【附圖說明】
[0015]為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚明了，下面結合實施例，對本發明進一步詳細說明，其中:
[0016]圖1是本發明的芯片式高通量生物檢測冷凍式均勻進樣方法操作流程圖。
【具體實施方式】
[0017]應該理解的是，這些描述只是示例性的，而并非要限制本發明的范圍。此外，在以下說明中，省略了對公知結構和技術的描述，以避免不必要地混淆本發明的概念。
[0018]請參閱圖1所示，本發明提供一種芯片式高通量生物檢測冷凍均勻進樣方法，包括如下步驟:
[0019]步驟1:將待測溶液充分攪拌均勻；
[0020]步驟2:將攪拌混勻的待測液體置于與芯片匹配的容器中；
[0021 ]步驟3:冷凍待測液體，獲得固態冰片；
[0022]步驟4:將固態冰片置于芯片上方，融化后實現液體均勻進入到芯片上的微型孔中，所述冰片融化進入到芯片上的微型孔中，是常溫融化自然進液。
[0023]本發明提供一種芯片式高通量生物檢測過程中冷凍式均勻進樣方法，只需要簡單的操作，不依賴復雜設備與平臺，進樣準確，效率高，均勻性好，尤其適用于數字化PCR檢測等要求單模板的高通量微反應體系。
[0024]圖1是本發明的芯片式高通量生物檢測冷凍均勻進樣方法操作流程圖。
[0025]如圖1所示，一種芯片式高通量生物檢測冷凍均勻進樣方法，所述方法包括步驟:
[0026]步驟I，將待測溶液充分攪拌均勻。
[0027]通過溶劑對待檢物質的充分溶解，使之均勻分布于溶液中，獲得自然狀態下理想的均一性。溶液體積根據芯片微孔的總容積進行配置，應控制在芯片總容積的90%以內。
[0028]步驟2，將溶液置于與芯片配套的容器中定型。
[0029]盛放溶液的容器需要具備與芯片形狀相同的底面以及適當高度的垂直管壁，目的是將液體定型為與芯片形狀相同的薄片。容器應當具備可拆卸的功能，或者有塑料膜等與容器隔離，方便拆取。
[0030]步驟3，將待測溶液冷凍，獲得固態冰片。
[0031]通過冷凍的方式將溶液由液態轉為固態。從而實現對待測物質的直接機械操作。
[0032]步驟4，將冰片置于芯片上方，融化后實現溶液均勻進孔。
[0033]通過自然融化使均勻固定在冰片中的待測物質隨著液化而進入芯片微孔。
[0034]步驟4中，冰片的轉移可以通過鑷子直接夾取置于芯片上方。
[0035]步驟4中，通常采用室溫將冰片溫和融化，通過降低溫度減慢融化速度可以使進樣過程更加穩定。
[0036]步驟4中，如采用可拆卸或倒扣式容器，可將容器直接置于芯片上方。
[0037]實施例
[0038]均勻進樣是數字化PCR檢測的關鍵步驟。數字化PCR是一種核酸檢測和絕對定量的新方法。同傳統PCR以及qPCR相比，數字PCR增加了一步分液的操作，將已經配好的包含有引物、模板、buffer、酶等組分的PCR反應體系分隔成了眾多微小的、獨立的反應體系。在分配的過程中，引物、酶等組分過量，而模板則是不過量的。模板DNA分子隨機地進入到各個小的反應體系中，經過PCR擴增后，包含模板的體系完成擴增，不包含模板的體系無擴增。模板DNA分子進入各個小的反應體系的過程滿足泊松分布規律，因此，檢測擴增PCR產物的信號強度，帶入泊松分布公式計算，即可計算出起始模板DNA分子的拷貝數。在芯片式數字化PCR中，通過數以萬計的芯片微孔實現分液，由于微孔數量巨大，可以將制備好的低濃度測試溶液分隔為單模板，確保真正的單分子擴增:即實現每個孔徑中最多含有I個模板，每個位點中包含DNA模板數為O或I，實現真正意義的單分子擴增。擴增完成后對包含有PCR擴增產物的液滴計數，就可以直接得到DNA模板分子數，實現絕對定量。進樣過程的均勻性是實現單模板的根本保證，同時也是決定數字化PCR實驗成敗的第一步。
[0039]本發明將能夠在進行數字化PCR實驗時，實現反應體系的分液過程自然而均勻，完成檢測試劑的均勻進樣，確保單模板數字化效果順利實現。通過實際操作發現，進行數字化PCR實驗采用本發明方法實現進樣后，可以將試劑溶液以高度的均勻性填充至微孔中，形成一致性非常好的分液效果。
[0040]本發明的一種芯片式高通量生物檢測冷凍均勻進樣方法，適用于大量微孔位點的芯片式反應檢測應用場合。尤其在超高通量生化檢測問題中，一次檢測采用的微孔數量達到數十上百萬，如何保證均勻有效進樣對傳統手段而言挑戰巨大。例如噴打的方式如果重復上百萬次，出錯幾率極高。本發明的方法不受微孔數量影響，操作簡便，可靠性高，無論芯片的孔距、尺寸、深度如何，一律可以用相同方式處理。對于更大通量的檢測手段，如ISFET芯片，位點可達上千萬，該方法優勢更加明顯。
[0041]應當理解的是，本發明的上述【具體實施方式】僅僅用于示例性說明或解釋本發明的原理，而不構成對本發明的限制。因此，在不偏離本發明的精神和范圍的情況下所做的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。此外，本發明所附權利要求旨在涵蓋落入所附權利要求范圍和邊界、或者這種范圍和邊界的等同形式內的全部變化和修改例。
【主權項】
1.一種芯片式高通量生物檢測冷凍均勻進樣方法，包括如下步驟: 步驟I:將待測溶液充分攪拌均勻； 步驟2:將攪拌混勻的待測液體置于與芯片匹配的容器中； 步驟3:冷凍待測液體，獲得固態冰片； 步驟4:將固態冰片置于芯片上方，融化后實現液體均勻進入到芯片上的微型孔中。2.根據權利要求1所述的芯片式高通量生物檢測冷凍均勻進樣方法，其中所述冰片融化進入到芯片上的微型孔中，是常溫融化自然進液。
【文檔編號】G01N1/42GK106018862SQ201610532200
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月7日
【發明人】劉元杰, 俞育德, 劉文文, 魏清泉
【申請人】中國科學院半導體研究所