一種檢測幽門螺桿菌基因及藥物代謝型的Miseq測序方法與流程

本發明涉及分子生物學檢測領域，具體涉及一種基于miseq高通量測序技術同時檢測幽門螺桿菌特異性基因、幽門螺桿菌耐藥基因和宿主藥物代謝酶cyp2c19基因的方法。
背景技術：
：幽門螺桿菌(helicobacterpylori)是一種螺旋形彎曲、微需氧的革蘭氏陰性菌，被廣泛證實為多種上消化道疾病的致病因子，是慢性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關淋巴組織(malt)淋巴瘤的最主要病因，也是胃癌發生的重要誘因之一。臨床上根除幽門螺桿菌的常用方法為兩種抗生素加上一種質子泵抑制劑(ppi)的三聯療法或者加上鉍劑的四聯療法。但是，目前幽門螺桿菌的根除率正在不斷下降，其中細菌的耐藥性和ppi的使用劑量不當是根除失敗的主要原因。幽門螺桿菌對抗生素耐藥的分子機制已被廣泛研究，其中較為重要的兩種抗生素克拉霉素和喹諾酮類藥物的耐藥機制已被研究的較為清晰。研究表明超過90％的克拉霉素耐藥的幽門螺桿菌都有23srrna的2142和2143位點發生突變，常見的突變有a2142g、a2143g、a2143c三種，也有一些其他的突變，如t2182c、c2245t、t2289c等，但都是集中在23srrna核酸可變區v區。國內的一項研究也顯示，超過80％的喹諾酮類藥物耐藥的幽門螺桿菌都有gyra基因發生突變，其中常見的突變有四種asn87lys、ala88val、asp91gly/asn/ala/tyr、ala97val，asp86asn較為少見，87和91突變在所有的耐藥菌株中發現，并且與高耐藥性相關，但都是集中在喹諾酮類藥物耐藥決定區(qrdr)發生突變。在分子水平上可以很好地檢測幽門螺桿菌對這兩種抗生素的耐藥情況，因此目前迫切需要開發一種幽門螺桿菌根除個體化的治療方案，明確藥物代謝酶類型和幽門螺桿菌耐藥性，針對性指導幽門螺桿菌感染用藥。高通量測序技術，又稱大規模平行測序技術，將dna(cdna)隨機片段化后、加接頭、制備文庫測序，通過對文庫中數以萬計的克隆繼續可逆延伸反應，熒光信號采集和信號轉化，最終獲得dna序列。通過擴增子建庫結合miseq測序也已被廣泛運用科學和臨床研究，最典型的運用為16srrna測序進行細菌種屬鑒定。技術實現要素：本發明的主要目的是提供一種準確、快速、檢測流程簡單的方法，可以同時檢測幽門螺 桿菌特異性、耐藥基因和宿主cyp2c19基因多態性位點，并能夠更加科學、安全、快速、準確指導幽門螺桿菌感染患者的用藥。為實現以上目的，設計覆蓋ureb、23srrna、gyra、cyp2c19*2、cyp2c19*3基因待測區域的特異性引物，擴增產物在360-460bp。進一步的，將各正向引物的5’端加上tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacag-特異引物，各反向引物5’端加上gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacag-特異引物。進一步的，將5對引物按照特定的比例合并，形成primerpool。進一步的，裂解胃黏膜組織樣本，同時提取宿主和幽門螺桿菌基因組。進一步的，利用primerpool擴增出待測樣本耐藥區域的擴增產物，并進行磁珠純化。進一步的，使用index引物對純化的擴增子進行第二次擴增，每個樣本帶上不同的index，此時樣本建庫完成。進一步的，通過對文庫的定量和質控，合格后進行miseq雙端測序；對測序結果進行質控和分析，濾去接頭等序列，比對耐藥區域和藥物代謝酶基因多態性位點，根據突變reads/未突變reads，計算出耐藥比例和藥物代謝酶類型。本方法只需要簡單的對胃黏膜樣本進行裂解處理，即可獲得幽門螺桿菌和宿主的全基因組。設計出幽門螺桿菌的特異性、耐藥和宿主藥物代謝酶cyp2c19基因，利用多重pcr技術將這些待測片段在一個pcr反應中實現擴增，結合index引物的擴增實現待測樣本的文庫構建，一次測序即可獲得幽門螺桿菌感染情況、耐藥情況及宿主藥物代謝酶cyp2c19基因多態性類型。該方法設計合理、操作流程簡單、檢測結果快速、準確、通量極高，可以滿足不同科研和臨床的檢測需求，有利于指導臨床關于幽門螺桿菌的檢測和根除，為幽門螺桿菌感染治療提供分子基礎。此外，本發明的方法配合使用illumina測序平臺的miseq測序儀，即可完成文庫測序。此款測序儀相比較于其他測序儀具有更加簡單、快速、經濟、靈活的優勢，整個建庫流程1天即可，測序也只需要在2天內即可完成，相對于其他測序平臺更加快捷，而且miseq測序的準確度目前來說是最準確的。附圖說明圖1是文庫構建示意圖。①第一步pcr擴增，靶基因的特異擴增和接頭添加。x：接頭和測序序列；y：特異引物序列；f：正向特異引物；r：反向特異引物。②第二步pcr完成測序文庫構建。fc：與測序芯片flowcell配對的序列；b：不同樣本的index序列；f：正向index引物；r：反向index引物。圖2是agilent2100dna1000kit文庫檢測圖具體實施方式為了使相關領域的科研人員和臨床工作人員能夠更好的理解本發明方案，下面結合實施方式和附圖予以詳細說明。但本發明并不限于以下實施方式。實施例1設計覆蓋ureb、23srrna、gyra、cyp2c19*2、cyp2c19*3基因待測區域的特異性引物，擴增產物在360-460bp，具體見表1。表1基因待測區域的特異性引物在上述各正向引物的5’端加上tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacag接頭序列，各反向引物5’端加上gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacag接頭序列，具體見表2。表2含接頭序列的引物3.將上述引物分別稀釋至10μm后進行混合，primerpool中這些引物的混合比例為：a-23s∶a-cyp2c19*2∶a-cyp2c19*3∶a-gyra∶a-ureb＝2∶0.5∶0.5∶1∶1。4.合成illumina公司的二次擴增index引物，稀釋至10um。目前常用的引物為20條，其中n70x系列12條，s50y系列8條，總共可以有96種引物組合，一般可以滿足樣本需求，具體引物序列見表3。表3二次擴增index引物引物名稱index引物序列(5’-3’)n701caagcagaagacggcatacgagattcgccttagtctcgtgggctcggn702caagcagaagacggcatacgagatctagtacggtctcgtgggctcggn703caagcagaagacggcatacgagatttctgcctgtctcgtgggctcggn704caagcagaagacggcatacgagatgctcaggagtctcgtgggctcggn705caagcagaagacggcatacgagataggagtccgtctcgtgggctcggn706caagcagaagacggcatacgagatcatgcctagtctcgtgggctcggn707caagcagaagacggcatacgagatgtagagaggtctcgtgggctcggn708caagcagaagacggcatacgagatcctctctggtctcgtgggctcggn709caagcagaagacggcatacgagatagcgtagcgtctcgtgggctcggn710caagcagaagacggcatacgagatcagcctcggtctcgtgggctcggn711caagcagaagacggcatacgagattgcctcttgtctcgtgggctcggn712caagcagaagacggcatacgagattcctctacgtctcgtgggctcggs501aatgatacggcgaccaccgagatctacactagatcgctcgtcggcagcgtcs502aatgatacggcgaccaccgagatctacacctctctattcgtcggcagcgtcs503aatgatacggcgaccaccgagatctacactatcctcttcgtcggcagcgtcs504aatgatacggcgaccaccgagatctacacagagtagatcgtcggcagcgtcs505aatgatacggcgaccaccgagatctacacgtaaggagtcgtcggcagcgtcs506aatgatacggcgaccaccgagatctacacactgcatatcgtcggcagcgtcs507aatgatacggcgaccaccgagatctacacaaggagtatcgtcggcagcgtcs508aatgatacggcgaccaccgagatctacacctaagccttcgtcggcagcgtc實施例2提取胃黏膜中的基因組(1)在無菌的2ml圓底ep管中，加入100μl組織裂解液和一個直徑3mm的無菌鋼珠；(2)將胃黏膜組織從樣本保存液中取出，轉移至含有裂解液和鋼珠的2ml圓底ep管中；(3)組織研磨儀研磨樣本，參數為室溫條件下50hz，60s，直至無組織塊；(4)充分研磨后，短暫離心，將勻漿液體轉移至新的無菌1.5mlep管中；(5)將含有勻漿組織的1.5mlep管置于95℃金屬浴中孵育10分鐘，中間可顛倒數次；(6)迅速將ep置于4℃冰箱中孵育30分鐘；(7)冰箱中取出ep管，12000轉離心，5分鐘，收集上清到新的ep管中，即可得到宿主和細菌的全基因組。實施例3目的片段的擴增和純化(1)用按照比例混合好的pcr引物配制如下反應體系：反應總體系25μl，其中2*phusionhfbufferpcrmastermix12.5μl，模板3.5μl，混合引物primerpool2μl，ddh2o7μl。反應條件為95℃預變性3分鐘，循環內95℃變性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，20個循環；循環結束后72℃延伸5分鐘；10℃保存。(2)在25μl擴增產物中加入20μlagencourtampurexpbeads磁珠，吹打混勻，室溫放置5min；放入磁架上，2-5min后待液體變清，吸棄上清，緩慢加入新鮮配制的200μl80％乙醇洗滌，30s后吸棄乙醇，并重復一次；靜置磁架5-8min揮發乙醇；待磁珠中心開始干裂即加入32.5μl水進行洗脫；從磁架上移下來，反復吹吸均勻后室溫靜置5min；放入磁架，2-5min后待液體變清，吸取30μl上清至新的潔凈離心管中，即得到純化后的pcr產物。文庫建庫參考示意圖參考圖1實施例4測序文庫的構建、純化、定量、質控(1)利用pcr的方法完成文庫構建，反應總體系25μl，包括2*phusionhfbufferpcrmastermix12.5μl，純化后的擴增產物4μl，引物n70x1μl，引物s50y1μl，ddh2o6.5μl，反應條件為95℃預變性3分鐘，循環內95℃變性30秒，62℃退火30秒，72℃延伸30秒，15個循環；循環結束后72℃延伸5分鐘，10℃保存。(2)取以上反應中25μl擴增產物加入25μlagencourtampurexpbeads磁珠，吹打混勻，室溫放置5min；放入磁架上，2-5min后待液體變清，吸棄上清，緩慢加入新鮮配制的200μl80％乙醇洗滌，30s后吸棄乙醇，并重復一次；靜置磁架5-8min揮發乙醇；待磁珠中心開始干裂即加入52.5μl水進行洗脫；從磁架上移下來，反復吹吸均勻后室溫靜置5min；放入磁架，2-5min后待液體變清，吸取50μl上清至新的潔凈離心管中，即可得到已純化的文庫。(3)文庫定量和質控質控，配套使用agilent2100bioanalyzer分析儀和qubit2.0濃度測定儀，qubit2.0檢測文庫濃度，agilent2100檢測文庫大小以及濃度。本方法使用agilentdna1000kit進行濃度和大小測定，具體如下：1)將dna1000kit試劑盒中的染料(藍色蓋子)和膠(紅色蓋子)冰箱中取出，進行室溫避光平衡30min，；2)將染料混合均勻后，取25μl染料加入500μl膠中，渦旋10s混勻；3)轉移染料-膠混合物至試劑盒中的離心柱，室溫離心2240g，15min；4)吸取9μl染料-膠混合物加入至dna1000芯片的最右側第三個孔(有標記)，避免在移液過程中產生氣泡；5)擠壓注射器，從1ml位置至dna位置的卡槽，60s后松開注射器卡槽，注射器會自然上升，5s后松開底座的dna芯片；6)分別吸取9μl染料-膠混合物至dna1000芯片最右側第一、二孔(有標記)，避免氣泡產生；7)再剩余的13個孔中，分別加入5μldnamarker(綠色蓋子)；8)吸取1μldnaladder(黃色蓋子)至最右側第四個孔；9)將待測樣本加入到芯片的前3列，每個樣本吸取1μl；10)在搖床中，固定好dna芯片，2240rpm，混合60s；11)根據芯片類型，設定好agilent2100bioanalyzer參數，即可進行濃度的測定。agilent2100bioanalyzerdna1000kit文庫質控檢測圖參考圖2。實施例5文庫測序、數據分析(1)質控合格后的文庫進行測序前的稀釋，具體如下：1)根據agilent2100bioanalyzer和qubit2.0的檢測結果對文庫進行稀釋，此時用水稀釋即可，稀釋到2nm，充分混合均勻；2)用變性劑0.2n的naoh按1∶1稀釋2nm文庫，此時文庫濃度為1nm，稀釋時避免劇烈混合，用移液器吹吸均勻即可；3)變性劑稀釋后室溫放置5min；4)用測序試劑的雜交bufferht1對變性后的文庫進行終濃度稀釋，一般在10-15pm均可，充分混合均勻后，放置4℃冰箱保存，使用時取出。(2)文庫稀釋到合適的濃度后，即可按照每個樣本的數據量需求對不同文庫進行混合，本方法要求每個樣本的reads數不低于5000條，測序試劑選擇miseqreagentkitv2，pe500-cycles，具體測序操作參考illumina平臺的miseq使用說明書，簡單來說：先對miseq測序儀的管路進行清洗，測序試劑室溫化凍，測序儀參數設置，測序。(3)測序數據下機后，miseq測序儀對測序結果進行自動轉化，生成fastq格式的文件，通過比對每個樣本的測序結果，分析突變情況，得到不同胃黏膜樣本的幽門螺桿菌的感染情況、耐藥情況以及宿主藥物代謝酶類型，深度發掘數據，計算突變菌株和未突變菌株的比例，可得到混合感染中耐藥和敏感菌株的比例。當前第1頁12