一種黑木相思人工種子制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及植物組織培養技術領域，尤其是一種黑木相思人工種子制備方法。
【背景技術】
[0002]黑木相思(A.melanoxylon)原產地為澳大利亞南部，為相思類最高大喬木之一，最高可達35m，胸徑I?1.5m，由于種源差異較大，也有些僅高10?20m，胸徑0.5m。黑木相思因其木紋美麗、材質好，在家具及貼面板材上具有很高的應用價值。且木材的聲學性能優異，常作為優質小提琴背板。黑木相思的心材呈棕色至黑棕色，間有紅色條紋，木紋整齊且有斑點狀、雨點狀、鳥眼狀、提琴狀的美麗圖案。黑木相思耐寒、耐旱、耐瘠、具固氮根瘤，改土性能好，適合在我國的福建南部、廣東、廣西南部、海南等地生長。黑木相思屬強陽性樹種，喜光、耐干旱、耐瘠薄、壽命長，能耐-6°C低溫。淺根型，側根發達，在土層30cm以上的酸性土壤上生長良好。有固氮根瘤，枯落物豐富，改土性能好，是荒山、“四旁”、園林、公路的優良綠化樹種，對氟化氫、二氧化硫、氯氣抗性強，也可作污染區的綠化樹種，還是良好的蜜源植物和綠肥資源。
[0003]目前國內黑木的采種園少，國內生產的種子數量完全不能滿足市場需要，因此種子的主要來源是澳大利亞進口，一般都是澳大利亞沒有改良的原生種，原生種子苗由于不經過改良對國內氣候的適應性差，且分化嚴重。林業上一般采取無性系苗造林，可以解決上述問題。獲得無性苗的方法，通常利用優樹為材料進行扦插繁或組織培養技術，但目前黑木的組培技術有待進一步優化，組培苗在國內也相當的少價格也較高。扦插繁殖技術由于存在部位效應，需要采取頂部枝條。但是，優樹一般樹體高大且都是成年樹，不易采到頂部枝條，同時，由于樹體老化，扦插也不易成活。
[0004]農業生產中使用的天然種子，一般都是由種皮、胚乳和胚三部分構成。種皮通常在種子的外層起保護作用；胚乳含有大量的營養物質，是種苗萌發生長不可缺少的營養來源；胚由胚芽、胚軸、胚根和子葉構成，將來發成植株。隨著農業生物技術的發展，通過組織培養技術，可把植物組織的細胞培養成在形態及生理上與天然種子胚相似的胚狀體，也叫作體細胞胚。這種體細胞胚有于葉、根、莖分生組織的結構。科學家把體細胞胚包埋在膠囊內形成球狀結構，使其具備種子機能。所以，人工種子是一種人工制造的代替天然種子的顆粒體，可以直接播種于田間。所謂人工種子，就是將組織培養產生的體細胞胚和性細胞胚包裹在能提供養分的膠囊里，再在膠囊外包上一層具有保護功能和防止機械損傷的外膜，形成一種類似于種子的結構。
[0005]目前，人工種子的制備已經在多種植物，尤其是天然種子稀缺的植物的制備中獲得成功，從而為這些植物的繁殖提供大量種子。由于黑木相思在這方面還缺乏相關研究，因此目前還沒有黑木相思人工種子的報道。
【發明內容】
[0006]本發明提供一種黑木相思人工種子制備方法，不受季節限制，幼苗成活率近100%o
[0007]—種黑木相思人工種子制備方法，包括如下步驟:
[0008](I)外植體處理:將采回的黑木相思枝條剪去葉片，用1-3%洗衣粉溶液浸泡清洗3-7分鐘，再用自來水沖洗干凈；在超凈工作臺上用70-75%的乙醇震蕩漂洗10-50秒，用無菌水沖洗1-3次后，用0.08-0.12%的升汞溶液消毒5-10分鐘，用無菌水沖洗3-7次，吸干水；
[0009](2)誘導培養:截取帶I?2個腋芽莖段接種于誘導培養基上，上述誘導培養基為MS+0.3-0.7mg/L 6-BA+0.08-0.12mg/L IBA+25_35g/L 蔗糖 + 瓊脂，進行暗培養 6-8 天后轉到光照下培養，每天12小時燈光，光照強度1500?2000Lux，25°C?28°C，培養25?30天誘導產生出不定芽；
[0010](3)增殖培養:將上述誘導培養產生的不定芽轉到增殖培養基上，上述增殖培養基為 MS+0.5-0.7mg/L 6-BA+0.15-0.25mg/L NAA+25_35g/L 蔗糖 + 瓊脂，光照下培養，每天12小時燈光，光照強度1500?2000Lux，25°C?28°C，培養25?30天誘導產生出叢生芽；任選地，在上述增殖培養條件下，每25?30天繼代培養一次，上述繼代培養使用上述增殖培養基；
[0011](4)人工種子制作:將 1/2MS+0.3-0.5mg/L IBA+3.0 ?5.0 %海藻酸鈉 +1.0 ?3.0%殼聚糖溶液注入試管，將上述步驟(3)中增殖得到的叢生芽移進上述試管中的溶液內部，用2.0?3.0% CaCl2S液注入上述試管內壁，凝固5?lOmin，用清水沖洗出上述試管內的固化凝膠即得人工種子；
[0012](5)人工種子貯藏:將上述⑷制作的人工種子盛入無菌大培養皿并用Parafilm-M膜密封后，于4 °C條件下黑暗保存。
[0013]作為本發明的優選方案，上述步驟(I)的外植體處理具體為:將采回的黑木相思枝條剪去葉片，用2%洗衣粉溶液浸泡清洗5分鐘，再用自來水沖洗干凈；在超凈工作臺上用75%的乙醇震蕩漂洗30秒，用無菌水沖洗I次后，用0.1 %的升汞溶液消毒7分鐘，用無菌水沖洗5次，吸干水。
[0014]作為本發明的優選方案，上述步驟(2)的誘導培養具體為:截取帶I?2個腋芽莖段接種于誘導培養基上，上述誘導培養基為MS+0.5mg/L 6-BA+0.lmg/L IBA+30g/L蔗糖+瓊脂，進行暗培養7天后轉到光照下培養，每天12小時燈光，光照強度1500?2000LUX，25°C?28°C，培養25?30天誘導產生出不定芽。
[0015]作為本發明的優選方案，上述步驟(3)的增殖培養具體為:將上述誘導培養產生的不定芽轉到增殖培養基上，上述增殖培養基為MS+0.6mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+30g/L蔗糖+瓊脂，光照下培養，每天12小時燈光，光照強度1500?2000Lux，25 °C?28 °C，培養25?30天誘導產生出叢生芽；任選地，在上述增殖培養條件下，每25?30天繼代培養一次，上述繼代培養使用上述增殖培養基。
[0016]作為本發明的優選方案，上述步驟(4)的人工種子制作具體為:將1/2MS+0.4mg/LIBA+4.0%海藻酸鈉+2.0 %殼聚糖溶液注入試管，將上述步驟(3)中增殖得到的叢生芽移進上述試管中的溶液內部，用2.5% CaCl2S液注入上述試管內壁，凝固5?lOmin，用清水沖洗出上述試管內的固化凝膠即得人工種子。
[0017]作為本發明的優選方案，上述步驟(3)中進行30代上述繼代培養。
[0018]本發明的方法使黑木相思幼苗生產除了不受季節限制外，還具有更好的營養供應和抗病能力和方便貯藏和運輸的特點，通過本發明的方法得到的黑木相思人工種子栽培出的黑木相思幼苗成活率近100%，且無表型變異。研究發現，黑木相思在步驟(3)的增殖培養基中繼代30代，未發現有變異苗出現，說明只要培養基以及激素濃度配合使用恰當，可以高繼代培養。
【附圖說明】
[0019]圖1為本發明實施例1中誘導培養產生出不定芽的圖；
[0020]圖2為本發明實施例1中增殖培養產生出叢生芽的圖；
[0021]圖3為本發明實施例1中最終得到的人工種子的圖。
【具體實施方式】
[0022]下面通過具體實施例對本發明作進一步詳細說明。應當理解，這些實施例僅是示例性的，不應當理解為對本發明保護范圍的限制。
[0023]實施例中，除了乙醇的百分含量按照體積/體積百分含量(v/v%)計以外，其它溶液的百分含量均按照質量/體積百分含量(w/V% )計。
[0024]實施例中，MS是指組織培養中常用的MS基本培養基，1/2MS是指1/2MS基本培養基，6-BA是指6-芐氨基腺嘌呤，IBA是指吲哚丁酸，NAA是指萘乙酸。
[0025]實施例1
[0026]本實施例的黑木相思人工種子制備方法，包括如下步驟:
[0027](I)外植體處理:將采回的黑木相思枝條剪去葉片，用2%洗衣粉溶液浸泡清洗5分鐘，再用自來水沖洗干凈；在超凈工作臺上用75%的乙醇震蕩漂洗30秒，用無菌水沖洗I次后，用0.1 %的升汞溶液消毒7分鐘，用無菌水沖洗5次，吸干水。
[0028](2)誘導培養:截取帶I?2個腋芽莖段接種于誘導培養基上，上述誘導培養基為MS+0.5mg/L 6-BA+0.lmg/L IBA+30g/L蔗糖+瓊脂，進行暗培養7天后轉到光照下培養，每天12小時燈光，光照強度1500?2000Lux，25°C?28°C，培養25?30天誘導產生出不定芽。圖1示出了誘導培養產生出的不定芽。
[0029](3)增殖培養:將上述誘導培養產生的不定芽轉到增殖培養基上，上述增殖培養基為MS+0.6mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+30g/L蔗糖+瓊脂，光照下培養，每天12小時燈光，光照強度1500?2000Lux，25°C?28°C，培養25?30天誘導產生出叢生芽；在上述增殖培養條件下，每25?30天繼代培養一次，上述繼代培養使用上述增殖培養基。圖2示出了增殖培養產生出的叢生芽。
[0030](4)人工種子制作:將1/2MS+0.4mg/L IBA+4.0 %海藻酸鈉+2.0 %殼聚糖溶液注入試管，將上述步驟(3)中增殖得到的叢生芽移進上述試管中的溶液內部，用2.5% CaCl2溶液注入上述試管內壁，凝固5?lOmin，用清水沖洗出上述試管內的固化凝膠即得人工種子。圖3示出了最終得到的人工種子。
[0031](5)人工種子貯藏:將上述⑷制作的人工種子盛入