一種金葵花愈傷組織的培養方法
【技術領域】
[0001]本發明提供了一種金葵花愈傷組織的培養方法，屬于生物工程技術領域。
【背景技術】
[0002]大量文獻證明，多倍體植株較二倍體植株在營養器官上具有更高產量。因此，為獲得更高的產量科技工作者們常常對植株進行多倍體育種并已獲得成功，如四倍體草莓、八倍體小麥等。在多倍體育種中，難點之一在于如何有效地建立組織培養體系。常用的帶芽莖段組織培養具有工作量大，突變率小，篩選麻煩，死亡率高等缺點。因此，本領域亟需提供一種能夠通過繼代培養將微小的突變放大，并通過核型分析檢測出來的愈傷組織，以進行多倍體育種和細胞學的實驗研究。
【發明內容】
[0003]本發明提供了一種金葵花愈傷組織的培養方法，該方法首次實現了對金花葵進行愈傷組織培養，解決了目前對于金花葵組織培養所需條件的探究，填補了對金花葵研究的空缺。本發明提供的培養方法中利用無菌苗子葉為外植體和適宜的激素濃度來縮短培養周期。
[0004]實現本發明上述目的所采用的技術方案為:
[0005]一種金葵花愈傷組織的培養方法，包括以下步驟:(I)、種子消毒:將金葵花種子浸種后吸干種子表面的水分，然后采用氯氣消毒；
[0006](2)、將消毒后的種子接種在無菌苗培養基上，接種后放置于恒溫黑暗環境中，使種子萌發，萌發后移至恒溫溫室中繼續生長；所述無菌苗培養基由MS培養基、蔗糖和瓊脂組成，pH為5.8?6.0 ;
[0007](3)、選取播種后10?15天的無菌苗的子葉和真葉為外植體，切去葉片邊緣后放置在誘導培養基上并用鈍頭鑷子輕按葉片表面使其緊貼誘導培養基表面，用雙層石蠟封口膜封口 ；
[0008](4)、外植體接種后放置在28°C恒溫生化培養箱中培養，培養至出現愈傷組織；
[0009](5)、切下愈傷組織轉接至繼代培養基中繼續培養，培養至愈傷組織生長達到穩定期，完成培養；所獲得的愈傷組織形態穩定，用于研究多倍體育種和細胞學實驗。
[0010]步驟(I)中浸種具體為將金花葵干種子在50°C恒溫水浴鍋中浸泡30min，氯氣消毒時間為4h。
[0011]步驟(2)中無菌苗培養基位于錐形瓶中，其厚度為0.5cm ;錐形瓶選擇50mL、10mL或250mL規格，50mL和10mL錐形瓶接種I?2粒種子，250mL錐形瓶接種3?6粒種子，所述無菌苗培養基中蔗糖的濃度為30g/L，瓊脂的濃度為8g/L。
[0012]步驟(2)中培養溫度為25°C。
[0013]所述的誘導培養基和繼代培養基成分相同，由MS培養基、2，4-D、6-BA以及KT組成，pH 為 5.8 ?6.0，其中 2，4-D 濃度為 2.lmg/L，6_BA 濃度為 0.75mg/L，KT 濃度為 2.0mg/L0
[0014]與現有技術相比，本發明具有以下優點:目前在本領域中，查閱現有的文獻和專利，尚無有人對金花葵進行愈傷組織培養，因此本發明最先對金花葵愈傷組織培養進行研究，較秋葵屬其他物種如黃秋葵、紅秋葵等而言具有培養周期短、誘導成功率高、有效縮短實驗進程等特點。本方法獲得的愈傷組織形態穩定、易于培養，是多倍體育種和細胞學研究的良好材料。本發明提供的培養方法中，種子消毒簡單、消毒效果優良、對環境污染小，外植體獲取容易。通過實驗對比發現本方法對種子和外植體的毒副作用小，實驗容易成功。
【具體實施方式】
[0015]下面結合具體實施例對本發明做詳細具體的說明。
[0016]本實施例中所用的器材和試劑如下:材料:金葵花種子
[0017]器材:干燥器、1mL EP管、移液管、洗耳球、錐形瓶、“Z”型鑷子、水浴鍋、超凈臺、酒精燈、培養皿、恒溫培養箱。
[0018]試劑:濃鹽酸，高樂氏漂白液，MS培養基干粉，質量濃度均為5mg/L的2，4_D(2，4 一二氯苯氧乙酸)、6-BA(即6-芐氨基腺嘌呤或細胞分裂素)、KT (激素)。
[0019]本實施例中提供的具體培養方法如下:
[0020]1、種子消毒:將金花葵干種子在50°C恒溫水浴鍋中浸泡30min后吸干種子表面的水分，然后采用氯氣消毒4h。
[0021]消毒步驟如下:首先將待滅菌的種子放入1mL EP管中，然后將EP管放入干燥器內的支架上；然后在干燥器內放入燒杯，在燒杯中加入高樂氏漂白液，然后按照高樂氏漂白液:濃鹽酸=100:3的體積比在燒杯中加入濃鹽酸，加入濃鹽酸后迅速將容器密閉，使種子在容器內產生的氯氣作用下滅菌。
[0022]2、將消毒后的種子接種在無菌苗培養基上，接種后放置于25°C恒溫黑暗環境中，使種子萌發，萌發后移至25°C恒溫溫室中繼續生長；所述無菌苗培養基由MS培養基、蔗糖和瓊脂組成，pH為5.8?6.0 ;無菌苗培養基位于錐形瓶中，其厚度為0.5cm ;錐形瓶選擇50mL、10mL或250mL規格，50mL和10mL錐形瓶接種I?2粒種子，250mL錐形瓶接種3?6粒種子，所述無菌苗培養基中蔗糖的濃度為30g/L，瓊脂的濃度為8g/L。
[0023]3、選取播種后10?15天的無菌苗的子葉和真葉為外植體，切去葉片邊緣后放置在誘導培養基上并用鈍頭鑷子輕按葉片表面使其緊貼誘導培養基表面，用雙層石蠟封口膜封口 ；誘導培養基由MS培養基、2，4-D、6-BA以及KT組成，pH為5.8?6.0，其中2，4-D濃度為 2.lmg/L，6-BA 濃度為 0.75mg/L，KT 濃度為 2.0mg/L。
[0024]4、外植體接種后放置在28°C恒溫生化培養箱中培養，培養20天后出現愈傷組織；
[0025]5、切下愈傷組織轉接至繼代培養基中繼續培養，培養40天后愈傷組織生長達到穩定期，完成培養；繼代培養基由MS培養基、2，4-D、6-BA以及KT組成，pH為5.8?6.0，其中2，4-D濃度為2.lmg/L, 6-BA濃度為0.75mg/L，KT濃度為2.0mg/L。所獲得的愈傷組織形態穩定，用于多倍體育種和細胞學的實驗研究。
【主權項】
1.一種金葵花愈傷組織的培養方法，其特征在于包括以下步驟:(I)、種子消毒:將金葵花種子浸種后吸干種子表面的水分，然后采用氯氣消毒； (2)、將消毒后的種子接種在無菌苗培養基上，接種后放置于恒溫黑暗環境中，使種子萌發，萌發后移至恒溫溫室中繼續生長；所述無菌苗培養基由MS培養基、蔗糖和瓊脂組成，.pH 為 5.8 ?6.0 ; (3)、選取播種后10?15天的無菌苗的子葉和真葉為外植體，切去葉片邊緣后放置在誘導培養基上并用鈍頭鑷子輕按葉片表面使其緊貼誘導培養基表面，用雙層石蠟封口膜封P ; (4)、外植體接種后放置在28°C恒溫生化培養箱中培養，培養至出現愈傷組織； (5)、切下愈傷組織轉接至繼代培養基中繼續培養，培養至愈傷組織生長達到穩定期，完成培養；所獲得的愈傷組織形態穩定，用于研究多倍體育種和細胞學實驗。2.根據權利要求1所述的金葵花愈傷組織的培養方法，其特征在于:步驟(I)中浸種具體為將金花葵干種子在50°C恒溫水浴鍋中浸泡30min，氯氣消毒時間為4h。3.根據權利要求1所述的金葵花愈傷組織的培養方法，其特征在于:步驟(2)中無菌苗培養基位于錐形瓶中，其厚度為0.5cm ;錐形瓶選擇50mL、10mL或250mL規格，50mL和.10mL錐形瓶接種I?2粒種子，250mL錐形瓶接種3?6粒種子，所述無菌苗培養基中鹿糖的濃度為30g/L，瓊脂的濃度為8g/L。4.根據權利要求1所述的金葵花愈傷組織的培養方法，其特征在于:步驟(2)中培養溫度為25 °C。5.根據權利要求1所述的金葵花愈傷組織的培養方法，其特征在于:所述的誘導培養基和繼代培養基成分相同，由MS培養基、2，4-D、6-BA以及KT組成，pH為5.8?6.0，其中.2，4-D 濃度為 2.lmg/L，6-BA 濃度為 0.75mg/L，KT 濃度為 2.0mg/L。
【專利摘要】本發明提供了一種金葵花愈傷組織的培養方法，包括以下步驟：將金葵花種子浸種后吸干種子表面的水分，然后采用氯氣消毒；將消毒后的種子接種在無菌苗培養基上，接種后放置于恒溫黑暗環境中，使種子萌發，萌發后移至恒溫溫室中繼續生長；選取接種后的無菌苗的子葉和真葉為外植體，切去葉片邊緣后放置在誘導培養基上并用鈍頭鑷子輕按葉片表面使其緊貼誘導培養基表面，用雙層石蠟封口膜封口；外植體接種后放置在恒溫生化培養箱中培養，培養至出現愈傷組織；切下愈傷組織轉接至繼代培養基中繼續培養，培養至愈傷組織生長達到穩定期，完成培養。本發明提供的培養方法中利用無菌苗子葉為外植體和適宜的激素濃度來縮短培養周期。
【IPC分類】A01H4/00
【公開號】CN105165615
【申請號】
【發明人】余光輝, 李林, 宋港港, 覃瑞, 劉虹, 李剛, 龔漢雨
【申請人】中南民族大學
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年9月26日