一種高效快速繁殖三葉青試管苗的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于植物的栽培技術領域，具體涉及一種高效快速繁殖三葉青試管苗的方 法。
【背景技術】
[0002] 三葉青，學名：三葉崖爬藤（TetrastigmahemsleyanumDielsetGilg)，又名金 線吊萌蘆、蛇附子、石老鼠，屬鼠李目，葡萄科，崖爬藤屬草質藤本。為我國特有藥用植物，廣 泛分布于長江以南各省份，主要有浙江、江西、福建、湖南、湖北、廣東、廣西、貴州、重慶、四 川、西藏、云南、海南和臺灣等地區，常生于山坡林下的灌叢中或山谷溪邊林下的巖石縫中， 生長海拔300~1300m
[0003] 三葉青全草均可入藥，以地下塊根和果實的藥用效果最好。其性平、味微苦，具有 清熱解毒、祛風化痰、活血止痛等功效，主治毒蛇咬傷、扁桃體炎、淋巴結結核、跌打損傷、小 兒高熱驚厥等疾病。目前臨床上還應用于抗癌、抗艾滋病毒，治療血液病、心腦血管疾病、 肝炎、病毒性腦膜炎等疾病。
[0004] 目前三葉青主要依賴于野生挖掘，近年來，由于過度采挖和生境破壞，致使鐵三葉 青野生資源已瀕臨滅絕，人工栽培已刻不容緩，但人工栽培存在種苗供應不足，通過組培的 方法快速繁殖種苗有很大的市場價值。
【發明內容】
[0005] 本發明要解決的技術問題是提供一種高效快速繁殖三葉青試管苗的方法，以解決 現有技術存在的栽培效率不高的問題。
[0006] 為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下：
[0007] -種高效快速繁殖三葉青試管苗的方法，它包括如下步驟：
[0008] (1)選取三葉青的枝條，去除葉片后剪成5~10cm的莖段，用去污劑清洗lOmin 后，再用流水沖洗lOmin;將剪切沖洗后的三葉青莖段于體積分數為75%的乙醇水溶液中 浸泡30~60s，再于氯化萊水溶液中浸泡5~8min;最后用無菌水沖洗3~5次后備用；
[0009] (2)將經步驟（1)處理后的三葉青莖段剪成帶1~2個腋芽的小段，接種于固體培 養基中；培養40~50天后腋芽萌發，摘取芽長1~2cm的腋芽備用；
[0010] (3)將步驟⑵中所得的腋芽置于增殖繼代培養基中培養50~60d;培養完成后， 三葉青腋芽生長成無根小苗且在莖節處產生腋芽；
[0011] (4)將步驟（3)中所得三葉青無根小苗剪成帶1個腋芽的小段（或腋芽）并移至 壯苗生根培養基中培養50~60天，得到三葉青成苗；
[0012] (5)選取步驟⑷中得到的4~5cm高，有2~3條根的三葉青成苗移到溫室中， 馴化培養10~15天后，用水沖洗去除培養基后，將三葉青成苗移栽到鋪有營養土的苗床 上，并遮陰保濕；待三葉青成苗的苗高達到15cm后，即可進行大田移栽。
[0013] 其中，為了繁殖出足夠多的可以進行步驟（4)中操作的三葉青無根小苗，可選取 步驟（3)中所得的側芽長度大于lcm的三葉青無根小苗重新剪成帶1個腋芽的小段（或腋 芽）接種于新的增殖繼代培養基中，重復步驟（3)中的培養過程。每轉接1次，增殖系數達 3~4。當繁殖出足夠數量的小苗時，將所得的三葉青無根小苗進行步驟（4)中操作。
[0014] 其中，對于上述步驟中是選擇帶腋芽的小段還是腋芽接種于新的增殖繼代培養基 中，重復步驟（3)中的培養過程，根據三葉青無根小苗的實際生長情況而定。若無根小苗的 基部腋芽較長，則剪取腋芽，若頂部腋芽較短，則剪取帶1個腋芽的小段
[0015] 步驟（1)中，所述的三葉青枝條為當年生半木質化莖段。
[0016] 步驟（1)中，所述的去污劑為家用洗衣粉。
[0017] 步驟⑴中，所述的氯化汞水溶液中，氯化汞的質量分數為0. 1%~0. 15%。
[0018] 步驟（2)中，培養條件為22~25°C，光照強度為300~1000勒克斯，光照時間為 11~13h/d;其中，所述的固體培養基的配方包括：6_芐氨基嘌呤0~1. 0mg/L+蔗糖25~ 30g/L+ 瓊脂 4. 5 ~6g/L+ 土豆汁 60 ~80g/L+ 活性炭 0? 5g/L+MS培養基+pH5. 6 ~5. 8 ; 其中，固體培養基的優選配方為6-芐氨基嘌呤1. 0mg/L+蔗糖30g/L+MS培養基+瓊脂6g/ L+ 土豆汁 60g/L+ 活性炭 0? 5g/L+pH5. 8。
[0019] 步驟（3)中，培養條件為25~28°C，光照強度為1000~2000勒克斯，光照時間為 11~13h/d;其中，所述的增殖繼代培養基的配方包括：6_芐氨基嘌呤0~1. 0mg/L+萘乙酸 0 ~0? 5mg/L+ 土汁 60 ~80g/L+ 鹿糖 25 ~30g/L+ 瓊脂 4. 5 ~6g/L+ 活性炭 0? 5g/L+MS 培養基+PH5. 6~5. 8 ;其中，增殖繼代培養基的優選配方為6-芐氨基嘌呤1. 0mg/L+萘乙 酸 0? 5mg/L+ 土豆汁 60g/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6g/L+ 活性炭 0? 5g/L+MS培養基+pH5. 8。
[0020] 步驟（4)中，培養條件為25~28°C，光照強度為1000~2000勒克斯，光照時間為 11~13h/d;其中，所述的壯苗生根培養基的配方包括：萘乙酸0. 2~0. 5mg/L+蔗糖25~ 30g/L+香蕉汁60~80g/L+瓊脂4. 5~6g/L+活性炭0? 5g/L+White培養基+pH5. 6~ 5. 8 ;其中，壯苗生根培養基的優選配方為萘乙酸0. 2mg/L+蔗糖30g/L+香蕉汁60g/L+瓊脂 6g/L+ 活性炭 0. 5g/L+White培養基+pH5. 8。
[0021] 步驟（5)中，溫室內溫度為28~33°C，光照強度為6000~8000勒克斯。
[0022] 步驟（5)中，所述的營養土由泥碳土和蛭石以3 :1的體積比混合而成。
[0023] 有益效果：與現有技術相比，本發明具有如下優點：
[0024] 1、本發明可直接用于工廠化規模化的種苗生產，具有污染少，增殖速度快，變異率 低，種苗整齊健壯，生產成本低，移栽成活率高等優勢。
[0025] 2、三葉青的莖段消毒后，剪成帶1~2個腋芽的小段接種到步驟（2)中的固體培 養基中，采用MS并配以適當的激素，與現有的三葉青腋芽萌發培養基相比，該方法腋芽萌 發并長到1~2cm的時間縮短10~15d，并且萌芽率高達80%以上，變異率小于1%，出芽 整齊。
[0026] 3、步驟（3)所述的繼代增殖培養基中，采用MS并配以適當生長素和細胞分裂素， 與傳統的繼代增殖培養基相比，該方法能更好更快的促進小苗生長和分枝，增殖系數可達 到3~4。
【具體實施方式】
[0027] 根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實 施例所描述的內容僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本 發明。
[0028] 實施例1
[0029] (1)剪取三葉青的莖段，去除葉片，剪成10cm左右的小段，用家用洗衣粉清洗 lOmin，再用流水沖洗lOmin，將清洗干凈的枝條帶入超凈工作臺，75%體積分數的酒精浸泡 45s，再放置于氯化萊水溶液中浸泡6min;無菌水沖洗3~5次。
[0030] (2)將步驟⑴得到的三葉青的無菌莖段剪成帶1~2個腋芽的小段接種于固體 培養基中，在22~25°C、光照度700勒克斯左右，光照時間12h/d的條件下，培養45d左右， 腋芽萌發，當芽長至1~2cm時，取腋芽備用；其中，所述的固體培養基組成為：6_芐氨基嘌 呤 1.Omg/L+ 鹿糖 30g/L+ 瓊脂 6g/L+ 土豆汁 60g/L+ 活性炭 0? 5g/L+MS培養基+pH5. 8。
[0031] (3)將步驟（2)得到的腋芽置于增殖繼代培養基中，在25~28°C、光照度1500勒 克斯左右、光照時間12h/d的條件下培養50~60d，三葉青腋芽生長無根小苗并在莖節處產 生側芽，等側芽長至lcm長時，將小苗重新剪成帶1個腋芽的小段重新接種到新的增殖培養 基，繼續培養，每轉接一次，增殖系數達3