一種篩選具有保護斑馬魚肝功能活性化合物的方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種篩選具有保護斑馬魚肝功能活性化合物的方法，特別設及一種利 用甲糞威制備斑馬魚肝功能損傷模型并利用其篩選具有保護斑馬魚肝功能活性化合物的 方法，屬于藥物篩選技術領域。
【背景技術】
[0002] 肝臟是藥物濃集、轉化、代謝的主要器官，尤其是口服藥物由胃腸道吸收后即進入 肝臟，藥物在肝臟內的濃度高于血液及其他器官。由于藥物或其代謝產物的毒性作用或機 體對藥物產生過敏反應，肝臟極易受到損害。目前已知多種藥物可導致肝損傷，如抗腫瘤的 化療藥、抗結核藥、解熱鎮痛藥、免疫抑制劑、降糖降脂藥、抗細菌、抗真菌及抗病毒藥等。隨 著我國人民生活水平日益提高，脂肪肝、酒精肝等慢性肝病發病趨勢也逐漸升高。肝臟疾病 已經成為人們健康的主要危害之一。目前應用的保肝藥物具有藥價昂貴、停藥后易反跳、易 產生耐藥性等缺點，急需研究新的高效的保肝藥物。因此，建立一種快速、有效的篩選保護 或改善肝功能活性化合物的方法，加快創新藥物的研發，對肝臟疾病的預防和治療具有重 大意義。
[0003] 藥物篩選模型分為=類：整體動物水平模型、組織器官水平模型和細胞分子水平 模型。目前整體動物水平模型主要W哺乳動物作為藥物篩選的觀察對象，具有結果可靠、 綜合全面的優點，但是耗時、耗資、耗力，不適合高通量篩選。體外實驗雖然操作簡單、周期 短，但不能準確反應藥物在體內微環境下的活性。而斑馬魚作為一種理想的脊椎模式生物， 其復制出的疾病與人類疾病有高度相似性，近年來被廣泛作為藥物篩選和安全性評價的工 具。與其他哺乳動物模型比，斑馬魚產卵量高，發育周期短，藥物用量少，可重復性強，可直 觀地反應出藥物的治療效果及毒副作用，更適用于大規模的化合物篩選研究。研究發現斑 馬魚在出生后48小時肝臟形態已初步形成，出生后60-72小時肝臟迅速生長直至達到合適 比例大小。在分子水平上，斑馬魚肝臟發育的分子機制與哺乳動物一致，其肝細胞功能W及 在多種肝臟病變中的組織病理學變化與人類亦非常相似。
[0004] 因此，選擇斑馬魚制備肝功能損傷模型并進一步作為保肝藥物篩選模型具有較高 的應用前景。但目前，制備肝功能損傷模型的損傷程度及對應保肝藥物篩選模型的評價標 準由于誤差較大，評價結果差異過大，無法實際應用。
【發明內容】
[0005] 本發明針對現有技術的不足，提供一種篩選具有保護斑馬魚肝功能活性化合物的 方法。
[0006] 本發明的技術方案如下：
[0007] 一種斑馬魚肝功能損傷模型的制備方法，步驟如下：
[0008] 將受精后2~3天發育正常的斑馬魚置于含有甲糞威濃度為5~30iiM的培養水 溶液中，26~30°C下恒溫培養24~72小時，制得斑馬魚肝功能損傷模型；
[0009] 根據本發明優選的，所述的培養水溶液包括如下組分：
[0010] NaCl5mM，KCl0. 17mM，CaClzO. 4mM，M拆〇4〇. 16mM，去離子水配制。
[0011] 根據本發明進一步優選的，所述培養水溶液還包括體積濃度不大于0. 5%的二甲 基亞楓。
[0012] 根據本發明優選的，甲糞威濃度為10yM。
[0013] 一種篩選具有保護斑馬魚肝功能活性化合物的方法，步驟如下：
[0014] (1)將受精后3天的發育正常的斑馬魚置于含有甲糞威濃度為5~30iiM的培養 水溶液中，培養24~72小時，制得肝損傷組斑馬魚；將發育3天的斑馬魚置于含有甲糞威 濃度為5~30yM、待測化合物濃度為0. 1yM~1000yM的培養水溶液中，培養24~72小 時，制得治療組斑馬魚；將發育3天的斑馬魚采用培養水在相同條件下培養24~72小時， 制得正常組斑馬魚； 陽015] 或者，將受精后3天的發育正常的斑馬魚，置于含有甲糞威濃度為5~30yM的培 養水溶液中，培養20~28小時，去除死亡斑馬魚，用純水洗凈斑馬魚表面殘留液，然后將斑 馬魚分為兩組，一組移入培養水中，另一組移入含有待測化合物的培養水溶液中，將兩組斑 馬魚繼續培養24~48小時，培養水培養的一組為肝損傷組斑馬魚，含有待測化合物的培養 水溶液培養的一組為治療組斑馬魚；將發育3天的斑馬魚采用培養水在相同條件下培養斑 馬魚44~76小時，制得正常組斑馬魚；
[0016] (2)觀察步驟（1)制得的正常組斑馬魚、肝損傷組斑馬魚、治療組斑馬魚，記錄并 計算斑馬魚肝臟面積和斑馬魚體面積，按照如下公式計算肝臟面積指數：
[0017] 肝臟面積指數=肝臟面積/體面積X100% ;
[0018] (3)當肝損傷組斑馬魚的肝臟面積指數超出正常組斑馬魚的肝臟面積指數范圍， 且達到統計學上的顯著性水平（P<〇. 05)，則成功造成斑馬魚肝臟功能損傷模型；在斑馬魚 肝臟功能發生損傷前提下，當治療組斑馬魚的肝臟面積指數高于肝損傷組，且達到統計學 上的顯著性水平（P<〇. 05)，則待測化合物具有保護或改善肝臟功能的活性；
[0019] 所述的正常斑馬魚的肝臟面積指數為：
[0020] 受精后4d的斑馬魚肝臟面積指數為1. 99~2. 66%，受精后5d的斑馬魚肝臟面積 指數為3. 07~3. 82%，受精后6d的斑馬魚肝臟面積指數為3. 93~4. 84%，受精后的7d 斑馬魚肝臟面積指數為3. 25~4. 39%。
[0021] 根據本發明優選的，所述斑馬魚胚胎為肝臟特異表達巧光的斑馬魚胚胎。肝臟特 異表達巧光的斑馬魚胚胎可采用本領域普通市售產品，如國家斑馬魚資源中屯、銷售的轉基 因斑馬魚。
[0022] 根據本發明優選的，所述步驟（1)中的培養，溫度為26~30°C，光照培養，每天更 換培養水或培養水溶液。
[0023] 根據本發明優選的，所述步驟（1)中，正常組斑馬魚、肝損傷組斑馬魚、治療組斑 馬魚均至少做=組平行實驗，每組斑馬魚總數不低于15枚。進一步優選的，每組斑馬魚總 數為30~50枚。
[0024] 根據本發明優選的，所述步驟（1)中，甲糞威濃度為10iiM。
[00巧]根據本發明進一步優選的，所述培養液組分如下：
[0026]NaCl5mM，KCl0. 17mM，CaClzO. 4mM，M拆〇4〇. 16mM，去離子水配制。
[0027] 根據本發明優選的，所述步驟（2)還包括觀察前的預處理步驟：將需要觀察的斑 馬魚胚胎用質量濃度為0. 3%。的=卡因浸泡40~90s進行麻醉，然后用3%甲基纖維素固 定于載玻片上。
[002引根據本發明優選的，所述步驟（2)的觀察為在巧光顯微鏡下觀察。
[0029] 根據本發明優選的，所述步驟（2)的記錄為拍照記錄。
[0030] 根據本發明優選的，所述步驟似的計算為利用圖像處理軟件計算。
[0031] 有益效果
[0032] 1、本發明首次利用甲糞威建立斑馬魚肝功能損傷模型，建立的斑馬魚肝功能損傷 模型具有制作簡單、快速、穩定可靠和重復性好的優點，降低了肝功能損傷模型的制作成 本，提高了實驗研究結果的可靠性；
[0033] 2、本發明在利用甲糞威建立斑馬魚肝功能損傷模型的前提下，采用首次將肝臟面 積指數作為斑馬魚肝功能評價的檢測指標，二者結合后，更加科學、客觀，提高了結果的準 確性，克服了現有技術誤差較大的缺陷；
[0034] 3、本發明中所用的模式生物斑馬魚，既具有體外細胞株可快速篩選的優點，又具 有活體動物體內驗證的優勢，利用斑馬魚胚胎進行大規模化合物的肝功能保護活性評價， 有助于提高實驗效率和降低實驗成本。
【附圖說明】
[0035] 圖1為甲糞威對斑馬魚肝功能損傷的形態學照片；
[0036] 圖中：a為空白對照組；b為溶劑對照組；C為5yM的甲糞威處理組；d為10yM的 甲糞威處理組；e為15yM的甲糞威處理組；f為