一種內源性的非編碼小RNA miR-873的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫藥技術領域。本發明設及一種內源性的非編碼小RNA的用途， 具體設及一種miR-873在制備用于治療或者緩解慢性疼痛及嗎啡耐受的藥物上的應用。
【背景技術】
[0002] 嗎啡作為一種經典的阿片類鎮痛藥物，廣泛應用于臨床急慢性疼痛治療中。但是 嗎啡長期使用導致的嗎啡耐受（Mcxrphinetolerance,MT)是限制其臨床應用的一大醫學難 題。由于嗎啡耐受的機制尚不完全清楚，且缺乏有效的防治措施，因此嗎啡耐受一直是慢性 疼痛研究領域的熱點。
[0003] MicroRNAOniRNA,miR)是一類長度約為21-23個核巧酸的非編碼單鏈小分子RNA， 由具有發夾結構的約70~90個堿基大小的單鏈RNA前體（pre-miRNA)加工而來，能夠和 互補或部分互補的祀mRNA的3 ^末端非翻譯區（3'-UTR)結合，誘導祀mRNA降解或介導其 翻譯抑制，從而在轉錄后發揮調控祀基因的功能。既往對基因表達和功能改變的研究主要 集中于轉錄水平W及基因產物的翻譯后修飾調節，對祀基因HiRNA翻譯過程的調控研究甚 少。miR通過抑制祀基因mRNA翻譯或促進mRNA從翻譯復合體中分離降解，快速持久降低祀 蛋白水平，從而參與多種病理生理過程。近年研究表明，miRNA不僅與人類遺傳性疾病及神 經系統發育和一些重大疾病的發生發展密切相關，而且在慢性疼痛研究領域中也發揮重要 作用。我們采用miRNA忍片技術發現嗎啡耐受大鼠脊髓背角miR-873分子表達水平顯著上 調，且運些miRNAs的祀基因中有嗎啡耐受相關基因，miRNA調控基因表達是通過機體內源 性調控通路，具有更高的穩定性和組織相容性，更低的毒副作用，可能成為新的治療策略。
【發明內容】
[0004] 本發明的第一個目的是提供一種內源性的非編碼小RNAmiR-873的應用，制備用 于治療或者緩解慢性疼痛及嗎啡耐受的藥物，所述的非編碼小RNAmiR-873的序列為： GCAGGAACUUGUGAGUCUCCU。
[0005] 上述用于治療或者緩解慢性疼痛及嗎啡耐受的藥物包括：慢病毒介導的miR-873 干擾載體。
[0006] 根據miR-873序列，利用ShRNA設計程序，按照RNA干擾序列設計原則，設計干擾 祀點序列；將載體進行酶切，使其線性化，通過T4DNA連接酶與雙鏈干擾祀點序列進行連 接反應形成ShRNA表達載體，將連接好的產物轉入制備好的感受態大腸桿菌，對長出的克 隆進行酶切鑒定，挑選陽性克隆測序，進行測序比對后，鑒定陽性的克隆即為構建成功的 shmiR-873干擾慢病毒載體；然后對構建成功的shmiR-873干擾載體進行慢病毒包裝。
[0007] 具體是根據miR-873序列，利用ShRNA設計程序，按照RNA干擾序列設計原則，設 計干擾祀點序列 5' -AUAAGGAUUUUUAGGGCAUUA-3';將pLenR-GPH載體兩端分別WEcoRI、 BamHI為酶切位點進行酶切，使其線性化，通過T4DNA連接酶與雙鏈干擾祀點序列進行連 接反應形成ShRNA表達載體，將連接好的產物轉入制備好的感受態大腸桿菌，對長出的克 隆進行酶切鑒定，挑選陽性克隆測序，進行測序比對后，鑒定陽性的克隆即為構建成功的shmiR-873干擾載體；
[0008] 對構建成功的shmiR-873干擾載體進行慢病毒包裝，制備慢病毒穿梭質粒及其輔 助包裝原件載體質粒，所需的載體包括：pRsv-REV、pMDlg-pRRE、PMD2GW及所述的構建成 功的shmiR-873干擾載體，其中pRsv-REV，pMDlg-pRRE慢病毒轉移質粒能表達綠色巧光蛋 白GFP，pMD2G含有病毒包裝所必需的元件；4種質粒載體分別進行高純度無內毒素抽提，共 轉染肥K293T細胞；肥K293T細胞常規培養于含100血/LFBS的DMEM培養基；轉染前Id， 取對數期狀態的細胞，用膜蛋白酶消化后調整細胞密度為0. 5X1〇9個/L時，重新接種于 體積25mL的直徑15cm細胞培養皿，37°C，50mL/LC〇2培養箱內培養；當細胞密度達培養皿 60%~70%時，將IOug干擾載體，10.加gpMDlg-pRRE，10.加gpMD2G，9ugpRsv-REV加入 293. 3ulP冊.8的0.1XTEbuffer中，再加入155. 6ul雙蒸水，隨后加入50. 2ul2. 5M的 化Clz混勻，隨即加入500ul2X皿S，邊滴加邊攬拌至少2min，室溫靜置lOmin，將混合物分 散逐滴加入每個孔中；將培養皿放入培養箱中37°C，3%C〇2培養；轉染后1化更換為完全 培養液繼續培養，培養4化后，收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液，于4°C，400化/min離屯、 lOmin，去除細胞碎片，W0. 45ym濾器過濾，置于40血超速離屯、管中，4°C，25000r/min離 屯、20min后去上清液，W冷的PBS液分別溶于500yLDMEM和500yLPBS重懸病毒沉淀于 4°C溶解過夜。
[0009] 本發明研究表明miR-873通過調控祀基因A20參與嗎啡耐受的發生和維持。
[0010] 祀基因A20通過負向調節膠質細胞在嗎啡耐受條件下脊髓釋放的促炎因子TNFa 參與炎癥形成。
[0011] 本發明的第二個目的是提供一種內源性的非編碼小RNAMiR-873的第二種應用， miR-873 用于調控A20 基因（Gene10:7128)。
[0012] 本發明的第S個目的是提供一種內源性的非編碼小RNAsMiR-873的第S種應用， miR-873用于制備調控A20基因的制劑。
[0013] 本發明的第四個目的是提供一種內源性的非編碼小RNAsMiR-873的第四種應用， miR-873用于調控膠質細胞在嗎啡耐受條件下脊髓釋放的促炎因子TNFa，從而參與炎癥 形成。
[0014] 本發明的第五個目的是提供一種內源性的非編碼小RNAsMiR-873的第五種應用， miR-873用于制備嗎啡耐受條件下脊髓釋放的促炎因子TNFa的調控制劑。
[0015] 本發明證實miR-873通過調控TNFa誘導蛋白-3 (A20)參與嗎啡耐受形成。
[0016]TNFa誘導蛋白-3 (A20)又稱作A20,由TNFa，比-1，LPS等多種細胞因子通過激 活NFkB,啟動A20基因轉錄而表達。A20通過其N端的去泛素化可W抑制NFKB通路中接 頭蛋白如RIP1，TRAF6,NEMO等的功能，并通過其C端的泛素化活性促進RIPl的泛素化降 解，從而抑制IKK的活性，之后抑制NFKB的激活。A20在對炎癥免疫系統的調控中發揮 重要作用，其基因存在很多單核巧酸多態性（SN巧位點，運些SNP與許多自身免疫性疾病 如類風濕性關節炎，系統性紅斑狼瘡，銀屑病，克隆氏病等密切相關。我們研究發現嗎啡 耐受大鼠脊髓背角miR-873明顯上調，通過生物信息學軟件預測及文獻分析，我們預測A20 基因是miR-873調控的祀基因之一。TNF-Q是膠質細胞在嗎啡耐受條件下脊髓釋放的促 炎因子。A20可負向調節促炎因子TNFa參與炎癥形成，因此抑制miR-873的表達可W負 向調節TNFa，從而通過調節炎癥反應治療或緩解慢性疼痛或嗎啡耐受。因此，本發明提供 了miR-873在用于治療或者緩解慢性疼痛及嗎啡耐受的藥物上的應用。此外，還可W用于 制備調控A20基因的制劑，W及用于制備嗎啡耐受條件下脊髓釋放的促炎因子TNFa的調 控制劑，意義重大。
【附圖說明】
[0017] 圖1 :嗎啡耐受組（NS組）和生理鹽水對照組（化am組）包括miR-873在內的脊 髓背角差異表達HiiRNART-qPCR驗證結果。A、上調的miRNAs;B、下調的miRNAs;C、miRNAs 上下調差異倍數；同化am組比較，差異有統計學意義（*P<0. 05)。
[0018] 圖2 :實驗設計流程圖。
[001引圖3 :miR-873的序列圖及分別同祀基因A20的3' -UTR結合位點圖。
[0020] 圖4 :不同組大鼠甩尾試驗％M陽結果，沖<0. 05,與sham組相比，午<0. 05,與sham、NS、NC組相比。
[002。 圖5 :銷內注射慢病毒載體LV-shmiR-873對CCI大鼠機械痛闊和熱痛闊的影響。CCI手術前1天及銷內注射0, 1，3, 5和7天后測PMWT和PWTL值。'B'是CCI術前基礎痛 闊值時間點，'0'是銷內注射LV-shmiR-873前時間點（CCI術后第7天），'3'是銷內注射 LV-shmiR-873后第3天（CCI術后第10天）。與NS組及LV-NC組比較，沖<0. 05。
[0022] 圖6 :LV-shmiR-873在大鼠脊髓中免疫巧光結果A.LV-shmiR-873在脊髓中轉染情 況，箭頭所指為LV-shmiR-873(X200倍），B.LV-shmiR-873具體細胞轉染類型，綠色巧光為 LV-shmiR-873，紅色巧光為化UN(神經元標記物）。
[0023] 圖7:Westernblot及RT-PCR檢測各組A20的表達圖A為WB結果，B為RT-PCR 結果，沖<0. 05,與化am組比較，#P<0. 05與LV-NC組相比較。
【具體實施方式】
[0024] W下結合實施例旨在進一步說明本發明，而非限制本發明。
[0025] 實施例1 :
[0026] (1)研究脊髓背角及背根神經節值RG)miR-873在嗎啡耐受形成過程中的動態變 化
[0027] 采用Exiqon公司LNA(鎖核酸）技術microRNA表達譜忍片檢測嗎啡耐受形成后 第Id及第4d(銷內注射嗎啡后第7d及第IOd)的慢性嗎啡耐受組（NS組）及對照組（化am 組）腰段脊髓背角及DRG差異表達的miRNAs。預實驗已經完成嗎啡耐受形成后第Id腰 段脊髓背角的差異表達譜忍片檢測。采用莖環狀逆轉錄引物實時巧光定量PCR(stem-loop RT-qPCR，ABI公司，化qMan探針法）驗證miRNAs表達，首先利用miR序列特異性的莖環狀 反轉錄引物進行反轉錄，隨后聯合miR特異性的正義、反義qPCR引物W及TaqMan巧光探針 進行qPCR，