Il-31在調控間充質干細胞增殖和分化中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及再生醫學及基因工程領域，具體設及IL-31在調控間充質干細胞增殖 和分化中的應用。
【背景技術】
[0002] 間充質干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)最早由Pittenger等分離于骨髓， 后來在廝帶和脂肪等組織中也能分離得到。MSCs具有如下優點:MSCs可塑性很高，在體內外 誘導條件下能分化成軟骨、骨、肌肉、肌腫、初帶和脂肪等組織;MSCs具有歸巢能力，可W在 生物體內向受損和炎癥部位集中；MSCs能誘導或增加新血管的形成;MSCs缺乏顯著的免疫 原性，防止自身免疫；另外MSCs分離方便。近幾年來，再生醫學快速發展，由于胚胎干細胞用 于細胞治療受倫理道德的影響，并且有致癌的風險，所WMSCs取代胚胎干細胞用于細胞治 療已經成為一種趨勢。但MSCs在再生醫學和組織工程應用中也存在缺陷，例如：隨著細胞傳 代次數的增加，MSCs的形態發生變化，增殖能力和多向分化潛能等都逐漸下降。如何提高 MSCs的增殖能力和多向分化潛能已經成為急需解決的難題，解決運些問題將對MSCs應用于 再生醫學和組織工程產生重大影響。最近的研究發現，多能性基因0ct4，Sox2和化nog等對 MSCs的增殖和多向分化潛能起促進作用，抑制運些基因的表達能對MSCs增殖和多向分化潛 能產生抑制作用。通過基因工程的手段提高MSCs增殖和多向分化潛能已經成為研究的熱 點。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供IL-31在調控間充質干細胞 增殖和分化中的應用。
[0004] 本發明的目的通過下述技術方案實現：化-31在調控間充質干細胞增殖和分化中 的應用，基于本發明發明人首次發現轉染IL-31能促進MSCs的增殖和成脂或成骨分化潛能。
[0005] 所述的IL-31的氨基酸序列如下所示：
[0006] MA甜SGPSTSVLFLFiXLGGWLASHTLPV化LRPSDDVQKIVE化QSLSKMLL邸VE邸KG化VSQNYTLrcLSPDA QPP順I服PAIRAYLKTIRQLDNKSVIDEIIEHLDKLIFQDA陽TNISVPTDT肥CKRFILTISQQF沈CMDLALKS LTSGAQQATT。
[0007]所述的IL-31的編碼核巧酸序列如下所示：
[000引
ACACCCATGAATGTAAACGCTTCATCCTGACTATTTCTCAACAGTTTTCAGAGTGCATGGACCTCGCACTAAAATCA TTGACCTCTGGAGCCCAACAGGCCACCACTTAAo
[0009] 所述的調控為正調控，即促進作用。
[0010] 所述的IL-31在調控間充質干細胞增殖和分化中的應用，是將IL-31蛋白或能表達 比-31的核酸序列制備為促進間充質干細胞增殖和分化的制劑。
[0011] 所述的核酸序列優選為DNA序列。
[0012] 所述的IL-31在調控間充質干細胞增殖和分化中的應用，是WIL-31基因為祀位 點，將能促進IL-31基因轉錄和表達的物質制備為促進間充質干細胞增殖和分化的制劑。
[0013] 所述的物質優選為0ct4轉錄因子。
[0014] 本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果:本發明是基于本發明發明人首次 發現轉染IL-31能促進MSCs的增殖和成脂或成骨分化潛能得到的成果。本發明將含有IL- 31、sh比-31、0(3*4、3}1〇(3*4和空質粒的慢病毒分別轉染至15〔3中進行表達，發現轉染0(3*4或 比-31質粒都能促進MSCs的增殖和成脂或成骨分化潛能，而轉染sh0ct4或shIL-31都能抑制 MSCs的增殖和成骨或成脂分化潛能。0ct4促進MSCs的增殖和成骨或成脂分化潛能已經被報 道，在本研究中被作為陽性對照。本發明掲示了細胞因子IL-31對MSCs的自我更新和多向分 化潛能起著關鍵調節作用提供了理論依據，為將MSCs用于再生醫學和組織工程奠定了必要 的基礎。
【附圖說明】
[0015] 圖1是本發明實施例1中將含有0ct4、比-31、sh0ct4、shIL-31的慢病毒重組載體和 作為對照的慢病毒空質粒分別感染UC-MSCs后，采用MTT方法檢測細胞因子IL-31對UC-MSCs 增殖影響的結果圖；其中，沖<0.01相對于不同天數的空質粒對照。
[0016] 圖2是本發明實施例2中將含有sh0ct4、sh化-31的慢病毒重組載體和作為對照的 慢病毒空質粒分別感染UC-MSCs后，檢測細胞因子IL-31對UC-MSCs的成脂或成骨分化作用 的結果圖。
【具體實施方式】
[0017] 下面結合實施例及附圖對本發明作進一步的詳細描述，但不用來限制本發明的范 圍。若未特別指出，實施例均參照常規實驗條件，或者參照試劑盒制造廠商的說明書進行。 實施例中所用到的工程菌、細胞株均為商業化的菌株或細胞株。大腸桿菌感受態細胞的制 備按照《分子克隆》進行制備。
[001引實施例1采用MTT方法檢巧U比-31對UC-MSCs增殖的影響。
[0019] (1)比-31和shIL-31慢病毒表達載體的構建。
[0020] 1)比-31基因引物的設計。
[0021] 用Primer 5.0軟件設計擴增IL-31基因開放閱讀框的引物，引物兩端酶切位點分 別為BamH I和化nd虹，引物由上海生工生物有限公司合成，引物的序列如下：
[0022] 比-31 正向引物：5' -TAGGATCCTCCCACACGTTGCCCGT-3' ；
[0023] 比-31 反向引物：5' -GCAAGCTTAGTGGTGGCCTGTTG-3'。
[0024] 2)擴增 IL-31 基因。
[002引 W人Th2細胞(購自上海哈靈生物科技有限公司）的cDNA為模板擴增比-31基因。
[0026] PCR擴增的反應體系如下：
[0030] 3)比-31基因的回收。
[0031] 將上述PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，并用Gel Extraction Kit(Omega)對PCR 產物回收，實驗步驟按試劑盒說明書，略有改動，步驟如下：
[0032] A、用手術刀片切下含有目的片段的瓊脂糖膠，盡量切除DNA片段周圍多余的瓊脂 糖膠W減少凝膠體積。
[0033] B、將凝膠塊置于1.5ml微量離屯、管中。加入與凝膠等體積的Binding buffeH X p2)。將混合物置于50-55°C，7min，直到凝膠完全溶解。
[0034] C、將化Bind DNA離屯、柱置于2ml收集管中，將70化1 DNA/瓊脂糖溶液加至化Bind DM離屯、柱，室溫下，10，000 X g離屯、Imin。
[00巧]D、棄去液體，將化Bind DNA離屯、柱重新放回相同的收集管，向化Bind DNA離屯、柱 中加入300μ1 Binding buffe;r(Xp2)，室溫下，10,000Xg離屯、Imin，洗HiBind DNA離屯、柱， 棄去流出液并重新使用收集管。
[0036] E、加入70化1無水乙醇稀釋的洗涂緩沖液洗涂化Bind DNA離屯、柱，室溫下10,000 Xg離屯、Imin。
[0037] F、棄去液體并最大轉速空柱離屯、2minW干燥離屯、柱基膜。
[0038] G、將化Bind DNA離屯、柱置于干凈的1.5ml離屯、管，向離屯、柱基膜中間滴加15-3化1 洗脫緩沖液，室溫放置Imin后W13，OOOg離屯、Imin洗脫DNA。
[0039] 4)比-31基因表達載體的構建。
[0040] 將回收的比-31 DNA片段和pGL3-Basic真核表達載體(Promega公司）經過BamH巧口 化nd虹雙酶切處理，用T4 DNA連接酶將雙酶切后的比-31 DNA片段克隆至經雙酶切的pGL3- Basic真核表達載體中，然后轉染大腸桿菌D冊α感受態細胞，使用正向引物和反向引物對克 隆進行篩選，將篩選得到的陽性克隆送去測序，DNA測序表明序列正確，命名為pGL3-比-31。 [0041 ] 5)比-31慢病毒質粒的構建。
[0042] A、使用BamH I單酶切pGL3-比-31及慢病毒載體pLVX-IRES-ZsGreenl (購買于漢恒 生物科技有限公司）；
[0043] B、使用T4 DNA連接酶將化-31 DNA片段亞克隆入BamH I單酶切線性化的慢病毒轉 移質粒化VX-IRES-ZsGreenl，然后轉染大腸桿菌D冊α感受態細胞，通過限制性內切酶化nd 虹單酶切初步鑒定重組質粒，將鑒定正確的克隆送上海生工生物有限公司進行DNA測序，測 序正確的克隆命名為pLVX-比-31-ZsGreenl;大量提取質粒W備轉染用。
[0044] 6)sh比-31慢病毒質粒的構建。
[0045] 在上海生工生物有限公司合成比-31 shRNA頸環結構對應的DNA序列（含有趾0巧口 化〇1酶切位點），使用趾〇1單酶切比-31 shRNA頸環結構對應的DNA序列及慢病毒載體pLVX- IRES-ZsGreenl，使用T4 DNA連接酶將化-31 shRNA頸環結構對應的DM序列克隆入線性化 的慢病毒質粒載體 pLVX-IRES-ZsGreenl，命名為pLVX-sh化-31-ZsGreenl。化-31 shRNA 頸 環結構對應的DNA序列如下：
[0046] 5 '-CTCGAGAGAGGGCTACCTGGAGACACCATTG-3 '。
[0047] (2)0ct4和sh0ct4慢病毒表達載體的構建(在本實驗中做為對照組）。
[004引l)0ct4基因引物的設計。
[0049] 用Primer 5.0軟件設計擴增0ct4基因開放閱讀框的引物，引物兩端酶切位點分別 為化〇1和化〇1。引物由上海生工生物有限公司合成，擴增0ct4的引物序列如下：
[0050] 0ct4正向引物：5'-CCGCTCGAGAGGATGGCGGGACACCTGGCTT-3' ；
[0化 1 ] 0ct4反向引物：5'-CATGCCATGGAAGGGCAGGCACCTCAGTTTG-3'。
[0化2] 2)擴增0ct4基因。
[0053] W人胚胎干細胞的cDNA(購自上海斯丹賽生物技術有限公司）為模板擴增0ct4基 因。PCR擴增的反應條件同上，PCR擴增的反應體系如下：
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