0化4]
[0化5] 3)0ct4基因的回收。
[0056]將上述PCR產物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳，并對PCR產物回收純化(步驟與上面IL- 31基因的回收相同）。
[0化7] 4)0ct4表達載體的構建。
[005引將回收的PCR產物通過化01和化01位點克隆至pGL3-Basic真核表達載體(Promega 公司），命名為pGL3-0ct4，DM測序表明序列正確。
[0059] 5)0ct4慢病毒質粒的構建。
[0060] A、使用趾〇1單酶切pGL3-〇ct4及慢病毒載體pLVX-IRES-ZsGreenl(購買于漢恒生 物科技有限公司）；
[0061 ] B、使用T4 DNA連接酶將0ct4 DNA片段與線性化慢病毒轉移質粒pLVX-IRES- ZsGreenl連接，然后轉染大腸桿菌D冊α感受態細胞，通過限制性內切酶Ncol單酶切初步鑒 定重組質粒，將鑒定正確的克隆送上海生工生物有限公司進行DNA測序，命名為pLVX-0ct4- ZsGreenl。將測序正確的克隆大量提取質粒W備轉染用。
[0062] 6)sh0ct4慢病毒質粒的構建。
[0063] 在上海生工生物有限公司合成0ct4 shRNA頸環結構對應的DNA序列（含有趾0巧口 化〇1酶切位點），使用趾〇1單酶切0ct4 shRNA頸環結構對應的DNA序列及慢病毒載體化VX- IRES-ZsGreenl，使用T4 DNA連接酶將0ct4 shRNA頸環結構對應的DNA序列克隆入線性化 慢病毒質粒載體pLVX-IRES-ZsGreenl，命名為pLVX-sh0ct4-ZsGreenl D〇ct4 shRNA頸環結 構對應的DNA序列如下：
[0064] 日 '-CTCGAGCCCTCACTTC ACTGCACTGCCATTG-3 '。
[0065] (3)將含有目的基因的慢病毒轉染UC-MSCs。
[0066] 1)慢病毒的制備。
[0067] A、接種人腎上皮細胞系293T細胞(購自上海酶研生物科技有限公司）于多聚賴氨 酸處理的100mm培養皿中，當細胞融合度達到80%時換液，將Ξ質粒(939日義2,91026,91^0(- ZsGreenl)共轉染293T細胞，培養化后更換培養基;pspax2和PMD2G購買于優寶生物。
[0068] B、轉染4她后收集病毒上清液，于4°C、40(K)r/min離屯、lOmin;收集離屯、后的上清液 并過濾；
[0069] C、4°C、25000r/min離屯、化后用無血清培養液溶解病毒沉淀；
[0070] D、使用有限稀釋法測定病毒滴度，分裝保存于-80°C冰箱中備用。
[0071] 2)慢病毒的轉染。
[0072] 將廝帶間充質干細胞化C-MSCs，上海拜力生物科技有限公司）接種于六孔板中，當 單層細胞生長密度達到80%~90%時加入1ml步驟1)得到的慢病毒顆粒(滴度為6X107TU/ ml),并加入聚凝胺至終濃度為祉g/mlW促進病毒吸附。按照W下5組進行轉染：化-31為轉 染化-31 質粒（即 pLVX-Ik31-ZsGreenl)的 UC-MSCs，sh比-31 為轉染化-31 shRNA(即 pLVX- sh比-31-ZsGreenl)的 UC-MSCs，0ct4 為轉染 0ct4 質粒（即 pLVX-0ct4-ZsGreenl)的 UC-MSCs， sh0ct4為轉染0ct4 shRNA(即pLVX-sh0ct4-ZsGreenl)的UC-MSCs，對照為轉染空質粒的UC- MSCso
[0073] (4)MTT 檢測 UC-MSCs 的增殖。
[0074] 1)將上述5組UC-MSCs分別做MTT實驗。
[0075] A、將轉染后的5組UC-MSCs培養于37°C、5%C02培養箱中；
[0076] B、每2地分別取出5組UC-MSCs中的3個平行樣，分別加入20化MTT液(MTT試劑盒購 于上海哈靈生物有限公司），繼續培養4h;
[0077] C、小屯、吸去孔內培養基，每孔加入10化L DMS0，低速振蕩lOmin，使結晶物充分溶 解；
[0078] D、在酶標儀上490nm波長處測定各孔吸光度(A)值，用t檢驗統計分析。
[0079] 結果顯示：比-31能促進UC-MSCs的增殖，sh化-31能抑制UC-MSCs的增殖（圖1)。在 此實驗中采用0ct4作為陽性對照，0ct4也能促進UC-MSCs的增殖，sh 0ct4也能抑制UC-MSCs 的增殖。
[0080] 實施例2檢測IL-31對UC-MSCs成脂和成骨分化的作用。
[0081 ] (l)UC-MSCs的成脂分化及鑒定。
[0082] l)UC-MSCs 的成脂分化；
[0083] A、采用含有sh0ct4或shIL-31的慢病毒分別轉染UC-MSCs，采用含有空質粒的慢病 毒轉染作為對照；
[0084] B、將上述3種轉染后的UC-MSCs按3 X 104cells/cm2的密度接種到含有生長培養基 的48孔板中，生長培養基為含有10%(V/V)FBS的DMEM/F12(FBS購自廣州宏新生物技術有限 公司；DMEM/F12購自廣州賽業生物科技有限公司）將接種好的培養板放在5 % C〇2的37 °C培 養箱中解育；
[00化]C、培養2地后，從每個孔中輕輕吸掉UC-MSCs的生長培養基，加入20化lUC-MSCs成 脂分化培養基A液，3天后換為成脂分化培養基B液，第4天又換回A液，如此循環，誘導分化21 天(成脂試劑盒購自廣州賽業生物科技有限公司）；
[0086] 2)UC-MSCs成脂分化的鑒定；
[0087] A、上述UC-MSCs分化21天后，吸出成脂分化培養基，用PBS沖洗1次，然后用4%多聚 甲醒溶液固定30min;
[008引 B、PBS沖洗兩次，用20化1油紅0染色30min;
[0089] C、用PBS 沖洗 2-3 次；
[0090] D、在光學顯微鏡下觀察和拍照圖像。
[0091] (2)UC-MSCs的成骨分化及鑒定。
[0092] 1) UC-MSCs 的成骨分化；
[0093] A、加入足量的0.1 %明膠溶液到48孔板中完全覆蓋其底部，旋轉直到明膠溶液覆 蓋整個培養板的底部，于室溫下至少靜置30min;
[0094] B、吸干明膠溶液，在超凈臺中放置30min，使剩余的溶液完全蒸發；
[0095] C、采用含有sh0ct4或shIL-31的慢病毒分別轉染UC-MSCs，采用含有空質粒的慢病 毒轉染作為對照；
[0096] D、將上述巧巾轉染后的UC-MSCs按3X104cells/cm2的密度接種到預先涂有明膠溶 液的培養板中，生長培養基為含有1〇%(￥八作85的0161/。12;將接種好的培養板放在5% C〇2的37°C培養箱中解育；
[0097] E、培養2地后，從每個孔中輕輕吸掉生長培養基，加入20化1 UC-MSCs成骨分化培 養基(成骨試劑盒購自廣州賽業生物科技有限公司）；誘導分化21天，每3天更換一次分化培 養基；
[009引2)UC-MSCs成骨分化的鑒定；
[0099] A、上述UC-MSCs分化21天后，吸出成骨細胞分化培養基，用PBS沖洗1次，然后用4% 多聚甲醒溶液固定30min;
[0100] B、PBS沖洗兩次，用20化1茜素紅染色3-5min;
[0101] C、用PBS 沖洗 2-3 次；
[0102] D、在光學顯微鏡下觀察和拍照圖像。
[0103] 結果顯示：sh比-31能降低UC-MSCs的成脂和成骨分化，表明化-31能增強UC-MSCs 的多向分化潛能（圖2)。在此實驗中采用sh0ct4作為陽性對照，sh0ct4也能降低UC-MSCs的 成脂和成骨分化，表明0ct4也能增強UC-MSCs的多向分化潛能。
[0104] 上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1.IL-31在調控間充質干細胞增殖和分化中的應用。2. 根據權利要求1所述IL-31在調控間充質干細胞增殖和分化中的應用，其特征在于： 所述的IL-31的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。3. 根據權利要求2所述IL-31在調控間充質干細胞增殖和分化中的應用，其特征在于： 所述的IL-31的編碼核苷酸序列如SEQIDN0.2所示。4. 根據權利要求1所述IL-31在調控間充質干細胞增殖和分化中的應用，其特征在于： 所述的調控為正調控。5. 根據權利要求4所述IL-31在調控間充質干細胞增殖和分化中的應用，其特征在于： 是將IL-31蛋白或能表達IL-31的核酸序列制備為促進間充質干細胞增殖和分化的制劑。6. 根據權利要求5所述IL-31在調控間充質干細胞增殖和分化中的應用，其特征在于： 所述的核酸序列為DNA序列。7. 根據權利要求4所述IL-31在調控間充質干細胞增殖和分化中的應用，其特征在于： 是以IL-31基因為靶位點，將能促進IL-31基因轉錄和表達的物質制備為促進間充質干細胞 增殖和分化的制劑。8. 根據權利要求7所述IL-31在調控間充質干細胞增殖和分化中的應用，其特征在于： 所述的物質為0ct4轉錄因子。
【專利摘要】本發明公開IL-31在調控間充質干細胞增殖和分化中的應用。本發明是基于本發明發明人首次發現細胞因子IL-31能促進MSCs的自我更新和多向分化潛能得到的成果。本發明通過基因工程的方法構建了IL-31、shIL-31、Oct4和shOct4的表達載體，通過慢病毒分別轉染到MSCs中，發現IL-31和作為陽性對照的Oct4能促進MSCs的增殖和多向分化潛能，而shIL-31和作為陽性對照的shOct4抑制MSCs的增殖和多向分化潛能。因此，這些研究結果將為研究IL-31在MSCs自我更新和多向分化潛能中的調控機理提供理論基礎，為將MSCs用于細胞治療奠定必要基礎。
【IPC分類】C12N5/10, C12N5/0775
【公開號】CN105586310
【申請號】CN201610084921
【發明人】魏星, 梁廣銓
【申請人】暨南大學
【公開日】2016年5月18日
【申請日】2016年2月14日