用t-test比較差異顯著性，沖<0.05差 異顯著，*沖<0.01差異極顯著。
[0042] 由上述實施例1制得的全緣馬尾藻多糖SPS在體外對肺癌A549細胞的增殖活性具 有抑制作用，實驗結果見圖2。全緣馬尾藻多糖SPSW濃度和時間依賴性方式顯著地抑制肺 癌A549細胞的體外增殖活性。不同濃度的全緣馬尾藻多糖SPS處理A549細胞24h后，對A549 細胞的增殖抑制率2%上升至92%，并且在SPS濃度為1.5mg/ml時其對A549細胞的抑制率高 達 92.1%。
[0043] 然而由上述實施例2制得的全緣馬尾藻多糖SPS-A在體外對肺癌A549細胞的增殖 活性結果顯示，在SPS-A濃度為1.5mg/ml時其對A549細胞的抑制率只有39.1 %，因此選擇水 提全緣馬尾藻多糖(SPS)作為本發明原料。
[0044] 實施例4
[004引 SPS體外給藥誘導肺癌A549細胞發生調亡
[0046] 調亡細胞的染色質呈現濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質分割成塊狀和調亡小體等 典型的調亡形態。細胞調亡早期，憐醋酷絲氨酸(PS)外翻，Annexin V是對PS有高度親和力 的重組蛋白，可作為外翻的PS的特異性探針并作為早期調亡的標志之一。
[0047] 實驗方法
[0048] 取對數期的A549細胞，膜酶消化成單細胞懸液，調整細胞密度為3 X 104個/ml;將 蓋玻片泡酸洗凈高壓滅菌后，放入12孔培養板中，注意防止染菌污染;取1ml制備好的細胞 懸液加到培養板中的蓋玻片上，放入細胞培養箱中繼續培養;24h后，取出培養板，加入0， 0.2，0.4and 0.6mg/ml的全緣馬尾藻多糖繼續培養；1化后，取出培養板，倒掉細胞上清液， 用4%多聚甲醒室溫固定lOmin，無菌PBS清洗Ξ次細胞;加入化echst 33258染色液室溫繼 續解育lOmin;巧光顯微鏡下觀察，隨機挑選Ξ個視野進行拍照保存。
[0049] 同樣取對數期的A549細胞，膜酶消化成單細胞懸液，接種6孔板，調整細胞數量為1 X 1〇6個/孔;24h后，加入0，0.4，0. Sand 1. Omg/ml的全緣馬尾藻多糖繼續培養；1化后，收集 A549細胞并用PBS清洗兩次，500μ1結合緩沖液重懸細胞沉淀，分別加入扣1 Annexin V- 門TC and PI，室溫避光解育lOmin，即刻使用流式細胞儀檢測。
[0050] 由上述實施例1制得的全緣馬尾藻多糖SPS在體外能夠誘導肺癌A549細胞發生調 亡。結果如圖3A所示，A549細胞經SPS處理12h并經化echst 33258染色后，其細胞核出現了 典型的調亡形態學特征，包括:染色質固縮、核碎裂、調亡小體形成等;Annexin V-FITC/PI 雙染實驗進一步驗證了SPS對A549細胞的調亡的誘導作用，結果如圖3B所示，不同濃度的 SPS處理肺癌A549細胞1化后，晚期（右上象限）和壞死(左上象限）的調亡細胞所占的比例分 別從0.7%上升至28.8% ,0.6%升高至12.7%。
[0051 ] 實施例5
[0052] SPS體外給藥誘導肺癌A549細胞線粒體膜電位下降
[0053] 線粒體在內源性的線粒體調亡通路中發揮重要作用，線粒體膜電位的降低受多種 壓力信號因子激活并且是細胞死亡級聯過程中不可逆轉的步驟，其被認為是線粒體調亡通 路中的重要事件，同時也是細胞早期調亡的標志之一。JC-1是一種膜滲透性的親脂性陽離 子巧光染料，其在線粒體內表現出電勢依賴性的積聚。正常線粒體內，JC-1聚集在線粒體基 質中形成聚合物，聚合物發出強烈的紅色巧光;不健康的線粒體由于膜電位的下降或喪失， JC-1只能W單體的形式存在于胞漿中，產生綠色巧光。因此顏色的變化非常直接的反映出 線粒體膜電位的變化。
[0054]實驗方法
[005引取對數期的A549細胞接種6孔板，調整細胞的數量為1 X 106個/孔;培養2地后，加 入0，0.4，0. Sand 1. Omg/ml的全緣馬尾藻多糖繼續培養；1化后，加入JC-1染料解育30min; 離屯、收集細胞沉淀，染色緩沖液洗兩遍，檢測緩沖液重懸后使用流式細胞儀檢測。
[0056] 由實施例1制得的全緣馬尾藻多糖SPS在體外能夠誘導肺癌A549細胞線粒體膜電 位的降低，結果見圖4,與對照組相比，SPS處理之后的A549細胞發射紅色巧光的細胞數明顯 降低而發射綠色巧光的細胞數顯著增加，說明了 A549細胞線粒體膜電位的降低。
[0057] 實施例6
[0058] SPS體外給藥誘導肺癌A549細胞活性氧的產生
[0059] 活性氧是線粒體氧化呼吸鏈的副產物并在細胞的氧化壓力中發揮重要作用，堆積 的活性氧會攻擊細胞內的核酸、蛋白和脂質，并最終導致細胞的死亡。線粒體是細胞內活性 氧的主要來源，活性氧的產生與線粒體膜電位的降低密切相關。過量的細胞內活性氧破壞 線粒體膜的完整性，導致細胞色素 C的釋放，激活caspase級聯反應，并導致細胞的調亡產 生。
[0060] 實驗方法
[0061] 將對數生長期的肺癌A549細胞接種6孔板，調整細胞數量為1 X 106個/孔;培養24h 后，加入0，0.4，0 . Sand 1. Omg/ml的全緣馬尾藻多糖繼續培養；1化后，加入活性氧探針 DCFH-DA解育20min，無血清培養基洗Ξ次后，收集細胞進行流式細胞儀檢測。
[0062] 由上述實施例1制得的全緣馬尾藻多糖SPS在體外能夠誘導肺癌A549細胞活性氧 的產生。與對照組A549相比，SPSW濃度依賴性的方式誘導A549細胞的活性氧水平的顯著增 加 (圖 5A，B)。
[0063] 實施例7
[0064] SPS體外給藥誘導肺癌A549細胞產生周期阻滯
[0065] 細胞周期分布被認為是細胞存活、生長和增殖的主要參數之一。不受控的細胞增 殖是腫瘤的典型特征，所W細胞周期阻滯代表著腫瘤治療的主要祀標。細胞周期監測點是 檢測細胞周期各時相間轉換的主要調節機制。細胞周期的正常進展若被各種細胞損傷影 響，細胞周期將會被阻滯在G2/M和S期。一旦細胞損傷不能被修復，細胞將停止異常的細胞 分裂而最終走向調亡或是壞死的過程。
[0066] 實驗方法
[0067] 將對數生長期的肺癌A549細胞接種6孔板，調整細胞數量為1 X 106個/孔;培養24h 后，加入0，0.4，0. Sand 1. Omg/ml的全緣馬尾藻多糖繼續培養；1化后，細胞通過離屯、收集， 經由冰浴的PBS洗涂兩次后，用70%預冷的酒精于4°C固定12h;固定的A549細胞離屯、收集并 用PBS洗兩次后，用PI(含化ase)于37°C避光解育30min，然后使用流式細胞儀檢測各個時相 的細胞數。
[0068] 由上述實施例1制得的全緣馬尾藻多糖SPS在體外能夠誘導肺癌A549細胞產生G2/ Μ細胞周期阻滯。實驗結果如圖6A，B所示，隨著SPS處理濃度的增加，G1期的細胞數從72.8% 下降到52.8%，而G2/M期的細胞數從12.3%上升到28.5%，說明了8?5誘導肺癌4549細胞 G2/M細胞周期阻滯。
[0069] 實施例8
[0070] SPS體外給藥對肺癌A549細胞調亡相關蛋白表達的影響
[0071] 調亡是受到嚴格調控的一個生理過程，其設及明顯的蛋白質表達譜的變化。在各 種腫瘤相關的蛋白中，促調亡和抗調亡蛋白通常被作為調亡的分子標記。作為調亡的誘導 者和調節者的腫瘤抑制蛋白P53,設及到DNA的損傷修復、細胞周期和調亡的控制等。Bcl-2 蛋白家族是調亡重要的調節者，并且在線粒體調亡通路中發揮著重要的作用。其中，Bcl-2 是該家族中抗調亡成員能抑制細胞色素 C從線粒體向胞質的釋放，Bax是該家族中促調亡成 員能促進細胞色素 C的釋放。而Bax/Bcl-2的比率是線粒體調亡通路中的關鍵檢查點，兩者 比率的升高意味著調亡產生。細胞色素 C一旦從線粒體釋放至胞質內，就會結合Apaf-1, ATP ,and procaspase-g形成調亡體復合物，激活起始者caspase-9和下游的效應者 caspase-3,隨后誘導PARP切割然后執行調亡過程，也即觸發caspase依賴性的線粒體調亡 通路的啟動。
[007引實驗方法
[0073] 將對數生長期的A549細胞接種六孔板，調整細胞數量為1 X 106個/孔;培養2地后， 加入0，0.4，0. Sand 1. Omg/ml的全緣馬尾藻多糖繼續培養；1化后，離屯、收集細胞，通過血球 計數板對細胞進行計數，加入相應量的裂解緩沖液，沸水浴煮lOmin制備蛋白樣品；隨后蛋 白樣品通過10 % SDS-PAGE膠分離并轉移至NC膜上，隨之相繼解育一抗和二抗，最后加入ECL 發光液檢測各蛋白表達量的變化。
[0074] 實驗結果如圖7所示，與對照組A549各蛋白的表達量相比，SPS處理A549細胞之后， 細胞P53蛋白的表達量顯著升高，說明SI^對A549細胞調亡的誘導設及P53相關的信號通路； Be 1 -2表達量降低、Bax表達量升高，故Bax/Bc 1 -2的比率顯著增加，表明SI^誘導的線粒體調 亡通路是通過對Bax/Bd-2比率的上調的方式來實現的；此外，SPS處理A549細胞后，其活性 形式，也即切割型的caspase-3, caspase-9和PARP的表達均顯著上升，進一步說明了 SF*S誘 導A549細胞線粒體調節的調亡。
[007引實施例9
[0076] SPS體外給藥對人廝靜脈