內皮細胞HUVEC增殖活性的影響
[OOW]如前述實施例3中所用的MTT比色法來評估全緣馬尾藻多糖SPS對體外培養的人廝 靜脈內皮細胞HUVEC增殖活性的抑制作用。
[0078]實驗方法
[0079]如實施例3中的實驗方法相同。
[0080]由上述實施例1制得的全緣馬尾藻多糖SPS在體外能夠抑制人廝靜脈內皮細胞 皿VEC的增殖活性，實驗結果如圖8所示，全緣馬尾藻多糖SPSW濃度依賴性方式抑制內皮細 胞的增殖。
[0081 ] 實施例10
[0082] SPS體外給藥對人廝靜脈內皮細胞HUVEC遷移活性的影響
[0083] 因為血管內皮細胞的遷移對新生血管生成是必須的，所W通過劃痕實驗和 Transwell實驗檢測了CS5931對細胞遷移的影響。
[0084] 實驗方法 [008引平板劃痕法：
[0086] 取對數期HUVEC細胞，膜酶消化成單細胞懸液，調整細胞密度為3.5 X ΙΟ4個/ml，取 100μΙ細胞懸液加入到96孔細胞培養板中，放入二氧化碳培養箱中培養24h;用無菌的20化1 的黃槍頭在每個孔中劃線，形成單細胞劃痕，并用無菌PBS沖洗兩次;將含有不同濃度的SPS (0，0.2，0.3，and 0.4mg/ml)和2 %胎牛血清的新鮮RPMI-1640培養基加入孔板中，每個濃度 梯度設立6個復孔;解育lOh后，倒置相差顯微鏡下觀察并隨機選擇3個視野進行拍照;HUVEC 細胞的遷移通過測定藥物處理前后劃痕的寬度來計算，其遷移率計算公式如下所示:遷移 抑制率（％) = [1-(藥物處理組的平均寬度/空白對照組的平均寬度）]Xl〇〇%實驗重復Ξ 次，數據W r±S;D表示，通過SPSS16,采用t-test比較差異顯著性，沖<0.05差異顯著，*沖 <0.01差異極顯著。
[0087] Transwell 遷移法
[0088] 該實驗是在Transwell Boyden chamberKorning Cos1:a;r,Cambridge,MA,USA)中 進行的，該小室含有8μπι的濾膜，可W允許細胞跨膜穿過，具體實驗方法如下：取對數期 HUVEC細胞，膜酶消化成單細胞懸液，用各個不同濃度的SPS(0，0.2，0.3，and 0.4mg/ml)調 整細胞密度為5 ΧΙΟ5個/ml;取10化1各濃度梯度的細胞懸液加入到化answell培養板的上 室中，設3個復孔;下室則放入0.6ml含20%胎牛血清的新鮮RPMI-1640培養基，放入二氧化 碳培養箱中培養化;取出培養板，倒掉小室內外的培養液，PBS清洗濾膜Ξ次，并用95 %的乙 醇室溫固定30分鐘，然后0.1%的結晶紫室溫染色20min;用PBS洗去多余的燃料，并用棉簽 將小室上表面的細胞擦掉，只留下遷移到濾膜下表面的細胞;倒置相差顯微鏡下觀察遷移 到下室的細胞，并拍照保存;計算細胞遷移抑制率，公式如下:抑制率（％) = [1-(藥物處理 組的遷移細胞數/空白對照組的遷移細胞數）]Xl〇〇%;實驗重復Ξ次，數據WF+SD表 示，通過SPSS16，采用t-test比較差異顯著性，沖<0.05差異顯著，*沖<0.01差異極顯著。
[0089] 由上述實施例1制得的全緣馬尾藻多糖SPS在體外能夠抑制人廝靜脈內皮細胞 HUVEC的遷移活性。圖9A 9C表明，在劃痕實驗中，隨著SI^濃度的增加，劃痕的愈合能力逐漸 降低，也即SPS對冊VEC細胞遷移活性的抑制作用呈劑量依賴性。Transwell實驗結果（9B 9D)表明，SPS W濃度依賴性方式引起冊VEC細胞遷移的抑制作用；0.2，0.3，and 0.4mg/ml SPS處理冊VEC細胞化后，其對內皮細胞冊VEC遷移的抑制率分別為42.9，61.0和67.9 %。上 述SI^對內皮細胞遷移能力的抑制作用是發生在細胞增殖沒有受到其顯著影響的時間和濃 度下（圖8 )，所W才真正意義上說明了 SI^是通過抑制血管內皮細胞的遷移來發揮其抗血管 生成作用的。
[0090] 實施例11
[0091] SPS體外給藥對人廝靜脈內皮細胞HUVEC管腔形成活性的影響
[0092] 內皮細胞管腔的形成是新生血管生成的重要過程，所W檢測SI^對皿VEC細胞管腔 形成能力的影響。
[009引實驗方法
[0094] 冊VEC細胞在3D基質層(Ma化igel膠)上形成管腔狀結構的能力的實驗思路如下： 將分裝的Ma化ige 1膠(BD，Be壯ord，MA，USA)從-20°C冰箱中取出，放入4°C冰箱中過夜解凍 成液體狀;將96孔培養板、無血清RPMI-1640培養基、1.5ml的小離屯、管放入-80°C冰箱中預 冷卻，備用；在冰上，將Ma化igel膠用預冷的1640培養基按照1:2的比例稀釋混勻；6化1/孔 的稀釋Matrigel膠加入到96孔板中，冰上放置lOmin，再放入37°C培養箱中聚合30min;取對 數期冊VEC細胞，膜酶消化成單細胞懸液，用各個不同濃度的SPS (0，0.2，0.3，and 0.4mg/ ml)調整細胞密度為3 X ΙΟ4個/ml ;Matrigel膠聚合之后，取不同濃度的SPS細胞溶液各 0.1ml加入聚合的膠上，37Γ細胞培養箱中繼續培養化;倒置相差顯微鏡下觀察管腔形成情 況，隨機挑選3個視野進行拍照保存。
[0095] 實驗結果如圖10所示:各個不同濃度的SPS處理冊VEC內皮細胞化后，能夠顯著抑 制血管內皮細胞在Matrigel膠上小管擬態的形成；高濃度的SPS甚至能夠完全破壞小管 (10D)。W上實驗結果表明了SPS能夠抑制冊VEC細胞的小管擬態的形成，同樣，該抑制作用 發生在冊VEC細胞的增殖活性沒有受到SPS明顯抑制的作用時間和作用濃度下，所W說SPS 確實能發揮抗血管生成活性。
[0096] 新生血管生成是一個多級的過程，靜止狀態的血管內皮細胞首先在血管生成因子 的刺激下增殖、遷移、侵入下層基質、形成管腔架構，最終形成一個成熟的功能化的血管網 絡。我們的實驗發現全緣馬尾藻多糖SPS能夠抑制內皮細胞的增殖、遷移和管腔擬態的形 成，說明SI^能夠在血管生成的多個水平上發揮抗血管生成作用。
[0097] 實施例12
[0098] SPS體內給藥抑制斑馬魚新生血管生成
[0099] 傳統上的血管生成的體內檢測都太復雜而很難進行大規模的藥物篩選，而斑馬魚 胚胎的通體透明性和在無功能性血管系統下存活Ξ到四天的特性使得斑馬魚模型能夠被 運用到體內的血管細胞生物學中。斑馬魚胚胎是評估抗癌藥物的抗血管生成活性的理想實 驗模型。
[0100] 實驗方法
[0101] 轉基因斑馬魚Tg(f 1 i la: EGFP)y 1飼養在自動循環水裝置中，水溫控制在28°C， 14h/l化光暗周期條件下;受精卵通過自然受精獲得，然后放入恒溫培養箱中28Γ繼續培養 2地;期間，及時鑒定并剔走死亡的呈白色的卵，防止污染水質。斑馬魚卵受精后2地，將魚卵 20個/孔分入24孔板中，加入不同濃度的全緣馬尾藻多糖SI^繼續解育4她;解育結束后，將 斑馬魚胚胎在室溫下用4%的多聚甲醒固定化，PBS沖洗Ξ次后將魚卵放置在載玻片上于倒 置巧光顯微鏡下觀察并拍照。
[0102] 由上述實施例1制得的全緣馬尾藻多糖SPS在體內能顯著抑制斑馬魚胚胎的血管 生成，實驗結果如圖11所示，對照組斑馬魚形成了健康的節間靜脈（ISV)和光滑的籃狀結構 腸下血管（SIV)(圖11A D)，而SI^加藥組的節間靜脈和腸下靜脈均出現了明顯的抑制作用 (圖 11B C E F)。
【主權項】
1. 一種全緣馬尾藻多糖的應用，其特征在于:全緣馬尾藻多糖作為制備抗癌藥物或抗 癌保健品中的應用；或，全緣馬尾藻多糖作為制備抗血管再生的藥物或抗血管再生成保健 品中的應用。2. 根據權利要求1所述的全緣馬尾藻多糖的應用，其特征在于:所述全緣馬尾藻多糖作 為制備抗非小細胞型肺癌藥物中的應用。3. 根據權利要求1所述的全緣馬尾藻多糖的應用，其特征在于:所述全緣馬尾藻多糖以 全緣馬尾藻原料采用熱水提取法提取，而后過濾、濃縮，濃縮后經醇沉、干燥，即得全緣馬尾 藻多糖。4. 根據權利要求1或2所述的全緣馬尾藻多糖的應用，其特征在于:所述全緣馬尾藻多 糖分子量范圍為100~200kDa，主要組成單糖為巖藻糖和半乳糖，兩者的摩爾比例為1~10: 1，硫酸根含量為15 %~50 %。5. 根據權利要求1所述的全緣馬尾藻的應用，其特征在于:所述全緣馬尾藻來源于褐藻 門，褐藻綱，墨角藻目，馬尾藻科的馬尾藻屬。
【專利摘要】本發明屬于生物醫藥技術領域，具體涉及一種全緣馬尾藻多糖的應用。全緣馬尾藻多糖作為制備抗癌藥物或抗癌保健品中的應用；或，全緣馬尾藻多糖作為制備抗血管再生的藥物或抗血管再生成保健品中的應用。本發明全緣馬尾藻多糖對抗癌和抗血管具有顯著的抑制作用，并公開了將全緣馬尾藻多糖應用于制備抗癌和抗血管生成藥物和保健品，能夠誘導癌細胞凋亡，降低線粒體膜電位，阻滯G2/M細胞周期，抑制內皮細胞增殖，抑制HUVEC細胞遷移，抑制HUVEC細胞的小管擬態的形成，從而對惡性腫瘤有一定的預防和治療作用。
【IPC分類】A61P35/00, A61K31/715, A61K36/03
【公開號】CN105596376
【申請號】CN201610061227
【發明人】金維華, 劉格, 孫超岷, 張全斌
【申請人】中國科學院海洋研究所
【公開日】2016年5月25日
【申請日】2016年1月28日