一株高效分泌d-阿洛酮糖 3-差向異構酶的基因工程菌株、構建方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于工業生物技術領域，具體涉及一株高效分泌表達D-阿洛酮糖3-差向異構酶的枯草芽孢桿菌基因工程菌株及其構建方法，以及將基因工程菌株用于發酵生產D-阿洛酮糖3-差向異構酶的應用。
【背景技術】
[0002]稀少糖是存在于自然界中但含量極少的一類單糖及衍生物。隨著人們對這類糖逐步了解，以阿洛酮糖與塔格糖為核心的功能性稀少糖研究得到迅速的發展，并引起眾多研究者的關注。D-阿洛酮糖(D-Psicose)是一種稀有糖，它是D-果糖在C3位置的差向異構體。D-阿洛酮糖極其少量地存在于某些商業化的糖類和農產品中，并且很難通過化學方法進行合成。比如，D-阿洛酮糖存在于小麥、甘蔗和甜菜糖蜜中，也少量地存在于商業化的D-葡萄糖和D-果糖中。
[0003]D-阿洛酮糖的甜度為蔗糖的70%，然而其能量值僅為0.007 kcal/g，且能量吸收效率僅為蔗糖的0.3%，所以D-阿洛酮糖是一種非常理想的低卡路里甜味劑。D-阿洛酮糖已經被證明具有降血糖的作用，還可以抑制肝臟脂肪合成酶腸道α-糖苷酶的活性，從而減少腹部脂肪的累積。D-阿洛酮糖針對6-羥多巴胺誘導的細胞凋亡具有神經保護作用，也可以抑制因高含量葡萄糖刺激產生的單核細胞趨化性蛋白-1的表達，因此D-阿洛酮糖在治療神經退行性和動脈粥樣硬化疾病方面有很高的醫療價值。在食品行業中，D-阿洛酮糖因為其甜度、高溶解度、極低卡路里和很低的血糖反應的特點而被視為一種理想的蔗糖替代品。向食物中添加D-阿洛酮糖可以增加食物的凝固作用，且阿洛酮糖可以通過與食物蛋白產生美拉德反應而使食物具有更好的味道。與D-果糖和D-葡萄糖相比，D-阿洛酮糖可以產生更多抗氧化的美拉德反應產物，以使食物維持較高的抗氧化狀態，從而具有更長的保質期。此外，還有報道稱D-阿洛酮糖可以提高蛋清蛋白的起沫性能以及黃油餅干的質量。總之，D-阿洛酮糖在食品、保健及醫藥品領域有著十分重要的應用價值。
[0004]2011年8月，D-阿洛酮糖被Π)Α認定為是安全的(GRAS)，并且被允許在一定范圍的食物和食品中用作添加劑。因此，D-阿洛酮糖具有廣闊的市場前景。據我們所知，D-阿洛酮糖只在日本(Matsutani Chemical Industry C0., Ltd, and Raresweet C0.Ltd.)和韓國(CJ Cheiljedang, Inc.)實現了工業化生產。目前，生產D-阿洛酮糖的技術主要包括提取法、化學合成法和生物轉化法。但是D-阿洛酮糖在自然界中的含量極低，提取法明顯不適宜D-阿洛酮糖的大規模生產;化學合成法不僅成本高、產量低，而且會產生比較嚴重的環境污染。生物轉化法可以利用自然界廣泛存在的單糖或某些單糖的加工副產物為原料，不僅成本較低，而且轉化效率也遠遠高于提取法，是規模化制備D-阿洛酮糖的重要技術手段。使用DTEase家族的酶通過差向異構作用使D-果糖與D-阿洛酮糖之間進行相互轉化是生物轉化法生產D-阿洛酮糖的主要方法。DTEase家族酶類的基因有多種來源，但是目前只有少數幾種酶得到比較系統的研究。1993年，Izumori et al ( 1993 )首次報道了來源于Pseudomonas cichorii ST-24的一種新酶，發現該酶可以催化酮糖在C3位置的差向異構，其最適底物為D-塔格糖，因此將其命名為D-塔格糖3-差向異構酶。Kim et al (2006)報道了來源于Agrobacterium tumefaciens的DTEase酶類的另一種特性，即可以特異性催化D-果糖和D-阿洛酮糖之間的相互轉化，因其對D-阿洛酮糖的底物特異性最高，遂將其命名為D-阿洛酬糖 3_差向異構酶(DPEase)。近年來，來自 Rhodobacter sphaerof ides SK011、Clostridium celluloyticm H10、Ruminocossus sp.5_l_39BFAA、Clostridium scindensATCC35704、Desmospora sp.8437 和Clostridium bolteae ATCC BAA-613的DPEase的基因也陸續被克隆和表達，其酶學性質也被詳細地研究。
[0005]到目前為止，文獻和專利中的DPEase酶類主要在大腸桿菌中進行表達，大腸桿菌外膜包含脂多糖，是一種可以引起人類和哺乳動物發熱的內毒素，而終產物中內毒素的去除則明顯加大了產物純化的復雜性;此外，在大腸桿菌中，蛋白的合成通常發生在細胞內，為了獲得大量的目標蛋白，需要將細胞進行破壞以使細胞內的蛋白釋放出來，這一附加的過程勢必將增加蛋白的生產成本。枯草芽孢桿菌為革蘭氏陽性細菌，是傳統的工業生產菌。其生產的蛋白可以被大量釋放到培養基中，從而大大縮減下游的蛋白純化過程，顯著降低目標蛋白生產成本;同時枯草芽孢桿菌細胞壁結構簡單且不含內毒素，美國FDA已將其列為GRAS (Generally Recognized As Safe)級別的微生物。因此，采用枯草芽孢桿菌進行D-阿洛酮糖3-差向異構酶的生產比大腸桿菌具有更大的優勢。
【發明內容】
[0006]本發明的目的之一是提供含有編碼來源于瘤胃菌D-阿洛酮糖3-差向異構酶基因rdpe的各種重組表達質粒。
[0007]所述D-阿洛酮糖3-差向異構酶基因rdpe的序列如SEQ ID N0.1所示。
[0008]本發明的目的之二是提供一株高效分泌表達D-阿洛酮糖3-差向異構酶的基因工程菌株1A751SD-XR，是將來源于質粒pMA5且包含木糖啟動子PxyIA和瘤胃菌D-阿洛酮糖3-差向異構酶基因rdpe的重組質粒為表達載體，以枯草芽孢桿菌為宿主構建得到的基因工程菌株，所述宿主是枯草芽孢桿菌168、14751、18600、18700、18800或以上菌株后代細胞中的一種。
[0009]在本發明的一種實施方式中，所述枯草芽孢桿菌是B.subtilis 1A751。
[0010]本發明的目的之三是提供該高效分泌表達D-阿洛酮糖3-差向異構酶基因工程菌株的構建方法，主要包括以下步驟= (I)PCR擴增或化學合成rdpe基因序列；(2)將rdpe基因插入表達質粒PMA5，構建重組表達質粒pMA5-RDPE ； (3)將pMA5_RDPE轉化枯草芽孢桿菌，獲得重組菌株1A751-HR;(4)以三個誘導型啟動子PxylA、Pglv和PsacB替換pMA5-RDPE上的組成型啟動子 Ρ_π，分別構建重組表達質粒 pMA5-PxyiA-RDPE、pMA5-Pgiv—RDPE 和 pMA5-PsacB-RDPE。(5)將 pMA5-PxyiA_RDPE、pMA5-Pgiv-RDPE 和 pMA5-Psac；B-RDPE 分別轉化枯草芽孢桿菌，獲得重組菌 1A751-XR、1A751-GR 和 1A751-SRJ6)敲除基因 xylAB(xylA 和 xylB)，獲得菌株 1A751SD，導入重組表達質粒pMA5-Pxy ia-RDPE，從而獲得基因工程菌株IA751SD-XR。
[0011]在本發明的一種實施方式中，重組表達質粒PMA5-RDPE上的啟動子Pfipall分別被誘導型啟動子PxyIA、Pglv和PsacB替換。
[0012]本發明的目的之四是提供應用上述基因工程菌分泌生產D-阿洛酮糖3-差向異構酶的方法，主要包括以下步驟:將重組菌用種子培養基活化后，將種子液以0.5%?5%接種量轉入裝液量50%?70%的發酵罐中，通氣量1.0?2.0 vvm，攪拌轉速100?800 rpm，pH不作控制，于37 °C培養;待發酵液OD_穩定后以恒定流速進行補料;發酵培養基成分為2.0%?4.0%蛋白胨、3.0%-7.0%酵母提取物、0.3%-0.9%磷酸氫二鉀和1.0%-3.0%可溶性淀粉，初始pH 7.2;補料培養基為2.0%?8.0%可溶性淀粉。當基因工程菌株需誘導表達時，待發酵液OD6qq達到0.8時添加一定濃度的誘導物。
[0013]在本發明的一種實施方式中，將重組菌用種子培養基活化后，將種子液以1.0%接種量轉入裝液量60%的發酵罐中，通氣量2.0 vvm,攪拌轉速200?600 rpm，pH維持在7.2，于37 0C培養;發酵培養基成分為3.0%蛋白胨、5.0%酵母提取物、0.6%磷酸氫二鉀和2.0%可溶性淀粉，初始PH 7.2;補料培養基為8.0%可溶性淀粉。當基因工程菌株需誘導表達時，待發酵液OD6qq達到0.8時添加一定濃度的誘導物。
[0014]本發明的目的之五是提供一種高效表達分泌D-阿洛酮糖3-差向異構酶的方法，以重組表達了瘤胃菌來源的D-阿洛酮糖3-差向異構酶基因rdpe的枯草芽孢桿菌為生產菌株，發酵生產D-阿洛酮糖3-差向異構酶RDPE。
[0015]在本發明的一種實施方式中，構建基因工程菌株1A751-HR、1A751-XR、1A751-GR、1八751-31?或147513011?;發酵培養基為2.0%~4.0%蛋白胨、3.0%~7.0%酵母提取物和0.3%?0.9%磷酸氫二鉀;于37°C、200rpm搖瓶發酵。當基因工程菌株需誘導表達時，待發酵液OD600達到0.8時添加一定濃度的誘導物。
[0016]本發明相比現有技術的有益效果:本發明首次以枯草芽孢桿菌為表達宿主，實現了瘤胃菌來源D-阿洛酮糖3-差向異構酶的高效分泌表達，重組D-阿洛酮糖3-差向異構酶的分泌量達到2.6 g/L，約占上清液總蛋白量的70%，酶活力約為95 U/mL。該產量是國際上已有報道的最高表達分泌水平。目前D-阿洛酮糖3-差向異構酶的生產宿主大多采用大腸桿菌且在胞內表達，純化蛋白前需要進行復雜的細胞破碎處理。本發明的枯草芽孢桿菌基因工程菌株高效分泌表達D-阿洛酮糖3-差向異構酶，大大簡化了蛋白純化流程且明顯降低了