UP-F: 5’-GAATTGCGTCCAATGTTTGAAAACG-3’
UP-R: 5’-TCTATTTTTTCCTCCTTTATGTTACCACTAC-3’
DN-F:5，-GTAGTGGTAACATAAAGGAGGAAAAAATAGAGCAAGCTGAAGAGACACAAGAAGAAC-3，
DN-R:5’-GTTGAACTAATGGGTGCTTTAGTTGAAGAACGTTTGATTCCCTGAAGTTCTATATC-3’
CR-F: 5，-TCTTCAACTAAAGCACCCATTAGTTC-3’
CR-R: 5’-TTATTCATTCAGTTTTCGTGCGGAC-3’
G-F:5 ’-CCAGTCCGCACGAAAACTGAATGAATAAATGAGTGATCGTCAGGCAGCCTTAG-3，
G-R: 5 ’-TGCTGCACTACTCCGTTATTATCCAAG-3’
UP為待敲除區域上游序列;DN為待敲除區域下游序列；CR為氯霉素表達盒和AraR表達盒的融合片段;G為待敲除區域片段。通過融合PCR方法將四個片段融合為一個DNA片段UP-DN-CR-G，然后直接轉化枯草芽孢桿菌感受態細胞1A751，涂布含氯霉素(12.5 ng/yL)平板進行篩選，并以菌落PCR進行驗證。挑選陽性克隆接種于無抗生素LB液體培養基中，37 °C、200 rpm條件下培養12?14 h，將菌液稀釋涂布含壯觀霉素(200 ng/yL)平板進行篩選，以菌落PCR進行驗證，獲得重組菌株1A751SD。
[0036]3)將重組表達質粒pMA5-PxyiA_RDPE轉化基因敲除菌株1A751SD，涂布含卡那霉素(50 ng/μυ平板進行篩選，以菌落PCR進行驗證，獲得基因工程菌株1A751SD-XR。
[0037]4)將所構建菌株1A751SD-XR進行搖瓶發酵，待發酵液OD6qq達到0.8左右時分別添加0.0%、0.5%、I.0%、I.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%和4.0%的木糖進行誘導。發酵72 h，進行酶活檢測和SDS-PAGE分析(如圖5所示)，具體方法同于實施例2。
[0038]結果顯示，當添加木糖濃度僅為0.5%時，胞外的酶活便達到最高值63 U/mL，為基因未敲除菌株的1.7倍;SDS-PAGE分析與以上結果一致。對胞外木糖濃度進行測定，72 h剩余木糖濃度為3.6%。以上結果說明敲除基因xylAB阻斷了枯草芽孢桿菌的木糖利用途徑，提升了胞內木糖累積量，從而大大提高了 RDPE的誘導表達水平。
[0039]實施例5 7.5 L發酵罐發酵生產RDPE
采用分批-補料發酵方式對所構建工程菌株1A751SD-XR進行發酵評價。首先將甘油凍存管中工程菌株1A751SD-XR在平板上劃線，挑取單菌落接種于裝有5 mL種子培養基(SR培養基)的試管中，37°C、200 rpm條件下培養16?18 h，然后轉接于裝有30 mL種子培養基(SR培養基)的搖瓶(250 mL)中，37°C、200 rpm條件下培養16?18 h。將種子液(1%接種量)轉入7.5 L發酵耀(New Brunswick Scientific co Inc, USA)中，裝液量3.0 L，發酵培養基成分為3.0%蛋白胨、5.0%酵母提取物、2.0%可溶性淀粉和0.6%磷酸氫二鉀，初始調整為pH7.2。通氣量2.0 vvm，攪拌轉速200?600 rpm，溶氧維持在20?40%，pH維持在7.2。發酵3 h后添加木糖使終濃度達到0.5%，以誘導目標蛋白的表達。待發酵液OD6qq穩定時，開始按照恒定流速補入8.0%可溶性淀粉，直到最終可溶性淀粉濃度達到4.0%。接種72 h后發酵結束，此時發酵液中RDPE的活性和產量最高，分別達到95 U/mL和2.6 g/L(如圖6所示)。在此條件下，重組RDPE的表達量約占上清液總量的70%，全為可溶性狀態。
【主權項】
1.一種高效分泌表達D-阿洛酮糖3-差向異構酶的枯草芽孢桿菌(BaciI Iussubtilis)基因工程菌株 1A751SD-XR。2.根據權利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，其是以來源于質粒pMA5且包含木糖啟動子PxyiA和瘤胃菌D-阿洛酮糖3-差向異構酶基因rdpe的重組質粒為表達載體，以枯草芽孢桿菌為宿主構建得到的基因工程菌株，所述宿主是枯草芽孢桿菌168、1A751、WB600、WB700、WB800或以上菌株后代細胞中的一種。3.根據權利要求2所述的瘤胃菌D-阿洛酮糖3-差向異構酶基因，其特征在于，其序列如 SEQ ID N0.1所示。4.根據權利要求2所述的宿主，其特征在于，其是以枯草芽孢桿菌1A751為出發菌改造而獲得的基因工程菌株，命名為1A751SD。5.一種構建權利要求1，2和4任一所述基因工程菌株的方法，其特征在于，主要包括以下步驟:(I)PCR擴增或化學合成rdpe基因序列；(2)將rdpe基因插入表達質粒pMA5，構建重組表達質粒pMA5-RDPE;(3)將pMA5-RDPE轉化枯草芽孢桿菌，獲得重組菌株1A751-HR;(4)以三個誘導型啟動子PxyiA、Pgiv和PsacB替換PMA5-RDPE上的組成型啟動子PHpaII，分別構建重組表達質粒pMA5-Pxy ia-RDPE、pMA5-Pgiv—RDPE 和 pMA5-PsacB-RDPE;( 5)將pMA5-Pxy ia-RDPE、pMA5-Pgiv-RDPE和pMA5-Psac；B-RDPE分別轉化枯草芽孢桿菌，獲得重組菌1A751-XR、1A751-GR和1A751-SR;(6)敲除基因xylAB(xylA和xylB)，獲得菌株1A751SD，導入重組表達質粒pMA5-PxyiA-RDPE，從而獲得基因工程菌株IA751SD-XR。6.按照權利要求5所述的方法構建的重組表達載體pMA5-RDPE、pMA5_PxyiA-RDPE、pMA5_Pgiv-RDPE 和 pMA5-PsacB_RDPE。7.按照權利要求5所述的方法構建的基因工程菌株1A751-HR、1A751-XR、1A751-GR和1A751-SR。8.權利要求1-7任一所述基因工程菌株在分泌生產D-阿洛酮糖3-差向異構酶中的應用方法。9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，主要包括以下步驟:將重組菌用種子培養基活化后，將種子液以0.5%?5%接種量轉入裝液量50%?70%的發酵罐中，通氣量1.0-2.0vvm，攪拌轉速100?800 rpm，pH不作控制，于37°C培養;待發酵液OD6qq穩定后以恒定流速進行補料;發酵培養基成分為2.0%-4.0%蛋白胨、3.0%-7.0%酵母提取物、0.3%?0.9%磷酸氫二鉀和1.0%?3.0%可溶性淀粉，初始pH 7.2；補料培養基為2.0%?8.0%可溶性淀粉；當基因工程菌株需誘導表達時，待發酵液OD6OO達到0.8時添加一定濃度的誘導物。10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，將重組菌用種子培養基活化后，將種子液以1.0%接種量轉入裝液量60%的發酵罐中，通氣量2.0 vvm，攪拌轉速200?600 rpm，pH控制在7.2，于37 °C培養;發酵培養基成分為3.0%蛋白胨、5.0%酵母提取物、0.6%磷酸氫二鉀和.2.0%可溶性淀粉，初始pH 7.2;補料培養基為8.0%可溶性淀粉；當基因工程菌株需誘導表達時，待發酵液OD6OO達到0.8時添加一定濃度的誘導物。11.一種高效分泌表達D-阿洛酮糖3-差向異構酶的方法，其特征在于，以重組表達了瘤胃菌來源的D-阿洛酮糖3-差向異構酶基因rdpe的枯草芽孢桿菌為生產菌株，發酵生產D-阿洛酮糖3-差向異構酶RDPE。12.根據權利要求11所述的方法，其特征在于，構建基因工程菌株1A751-HR、1A751-XR、.1A751-GR、1A751-SR或1A751SD-XR;發酵培養基為2.0%?4%蛋白胨、3.0%-7.0%酵母提取物和.0.3%~0.9%磷酸氫二鉀，pH 7.2；于37°C、200 rpm搖瓶發酵;當基因工程菌株需誘導表達時，待發酵液OD6qq達到0.8時添加一定濃度的誘導物。
【專利摘要】本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一株高效分泌D-阿洛酮糖？3-差向異構酶的基因工程菌株及其構建方法。本發明首先獲得了來源于瘤胃菌<i>Ruminococcus</i>？sp.？5_1_39B_FAA的D-阿洛酮糖？3-差向異構酶基因<i>rdpe</i>，構建重組表達質粒pMA5-RDPE并轉化枯草芽孢桿菌，實現了RDPE在枯草芽孢桿菌中組成型分泌表達。通過比較三個糖誘導型啟動子，得到最優誘導型啟動子P<i>xylA</i>，并明顯提高了RDPE的分泌水平。通過敲除木糖利用基因<i>xylAB</i>？(<i>xylA</i>和<i>xylB</i>)，阻斷了枯草芽孢桿菌的木糖代謝途徑，進一步提高了RDPE的分泌量，并使誘導劑木糖的最優誘導濃度由4.0%降低為0.5%。最終，采用分批補料方式，在7.5？L發酵罐中對工程菌株1A751SD-XR進行評價，RDPE的分泌水平最高可以達到95？U/mL？和2.6？g/L。
【IPC分類】C12R1/125, C12N1/21, C12N15/61, C12N15/75, C12N9/90
【公開號】CN105602879
【申請號】CN201610051547
【發明人】張大偉, 陳景奇, 付剛, 朱玥明, 孫媛霞
【申請人】中國科學院天津工業生物技術研究所
【公開日】2016年5月25日
【申請日】2016年1月26日