一種真菌菌絲總dna提取液及提取真菌菌絲總dna的方法
【技術領域】
[0001 ]本發明屬于真菌菌絲總DNA提取的技術領域，特別涉及一種真菌菌絲總DNA提取液及提取真菌菌絲總DNA的方法。
【背景技術】
[0002]在真菌的分子生物學研究中，真菌總DNA的提取至關重要。目前常用的提取方法主要有CTAB法、SDS提取法、尿素提取法及酶解法等。提取的步驟大體相似，關鍵在于如何有效地破碎細胞壁，有的是通過機械來進行破碎細胞壁，有的是通過酶等物質來消化去壁。由于真菌細胞壁上富含多糖等物質，因此即使是液氮冷凍干燥研磨后也很難被普通抽提液打破，而直接用酶去消化又常常得不到好的去壁效果。事實上，目前大部分實驗室所采用的破壁方法均是液氮冷凍干燥研磨，但是這些方法大多會用到有毒有機溶劑、酚等，而且操作時間較長，步驟較多。另外，使用液氮研磨容易凍傷皮膚，需要強力研磨，費時費力，受研缽數量的限制容易產生交叉污染，在研磨過程中真菌菌絲也容易損失，效率也不高，特別是一些單位和機構由于液氮及干冰不易獲取而使其受到嚴重限制。
[0003]因此急需一種操作簡便且適于DNA微量提取以用于直接進行PCR擴增的技術。
【發明內容】
[0004]針對上述問題，本發明開發了一種真菌菌絲總DNA提取液，其包括提取液I和提取液II;其中所述提取液I包括緩沖鹽、非離子表面活性劑、以及中性鹽的水溶液，其PH值為
7.5-8.5,特別是其pH值可以為7.8-8.2;所述提取液11包括緩沖鹽和陽離子表面活性劑，其pH值為7.5-8.5，特別是其pH值可以為7.8-8.2。
[0005]使用本發明的真菌菌絲總DNA提取液，可以取得如下的有益效果:
1)實現簡化真菌菌絲總DNA提取步驟的目的；
2)適用于真菌菌絲總DNA微量提取，這為難于獲得或僅能獲得小量的實驗材料提供了有效的實驗手段；
3)避免了有毒有機溶劑、酚等的使用；
4)可以簡化操作步驟，減少操作時間；
5)還避免了液氮研磨過程中容易造成凍傷皮膚的可能性。
[0006]在一個具體實施例中，所述陽離子表面活性劑為陽離子聚丙烯酰胺。其濃度可以為0.1-5 ppm，特別是1-3 ppm。
[0007]在一個具體實施例中，所述非離子表面活性劑為醇醚硫酸鹽;優選地為脂肪醇醚硫酸銨和/或脂肪醇醚硫酸鈉;更優選地為C12?C18的脂肪醇醚硫酸銨和/或脂肪醇醚硫酸鈉;最優選地為C12?C15的脂肪醇醚硫酸銨和/或脂肪醇醚硫酸鈉。
[0008]在一個具體實施例中，所述緩沖鹽選自Tris-HCl、磷酸鈉、磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉中的至少一種。
[0009]在一個具體實施例中，所述緩沖鹽的濃度為100-200 mM，優選為150-200 mM。
[0010]在一個具體實施例中，所述中性鹽為氯化鹽;優選地，所述氯化鹽為氯化鈉和/或氯化鉀。
[0011]在一個具體實施例中，所述中性鹽的濃度為100-200 mM，優選為150-200 mM。
[0012]在一個具體實施例中，所述真菌為白粉病菌(Cicinnobolus cesatii)。
[0013]本發明還提供了一種提取真菌菌絲總DNA的方法，包括如下步驟:
(1)收集真菌菌絲體；
(2)將真菌菌絲體置于如上所述的提取液I;
(3)凍融至少I次，優選凍融至少2次，更優選凍融至少3次；
(4)加入如上所述的提取液II;
(5 )去除不溶物，獲得含有真菌DNA的上清液。
[0014]在一個具體實施例中，以體積計，所述提取液I與所述提取液II的比例為1:(1-
5)，優選 10:(1.5-2.5)。
[0015]在一個具體實施例中，在步驟(3)中，冷凍的溫度為零下196°C至零下20°C，融化的溫度為40° C至70° C;優選所述冷凍的溫度為零下196° C，融化的溫度為50° C至60° C。至于凍融的時間，可長可短，一般來講以能夠凍住或解凍即可。
[0016]在一個具體實施例中，以離心的方式去除所述不溶物，優選離心速度為10000-15000 rpm，離心時間為1-5分鐘。在通過離心去除不溶物后，可以直接使用獲得的上清液用于下一步實驗操作，例如普通的PCR擴增、RT-PCR擴增等實驗。
[0017]在一個具體實施例中，還包括步驟(6)將所述上清液中的所述真菌DNA沉淀后溶于TE緩沖液中或去離子水中。經過該處理后，將將提取的DNA長期的冷凍保存，以備后續實驗使用。
【附圖說明】
[0018]圖1為實施例1-6以及對比例I提取的白粉病菌基因組DNA作為模板進行PCR擴增后的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測圖。其中，M為DNA分子量參照物，I為以實施例1的方法獲得的DNA樣品作為PCR模板，2為以實施例2的方法獲得的DNA樣品作為PCR模板，3為以實施例3的方法獲得的DNA樣品作為PCR模板，4為以實施例4的方法獲得的DNA樣品作為PCR模板，5為以實施例5的方法獲得的DNA樣品作為PCR模板，6為以實施例6的方法獲得的DNA樣品作為PCR模板，7為以對比例I的方法獲得的DNA樣品作為PCR模板。
【具體實施方式】
[0019]以下通過優選的實施例的形式對本發明的上述內容再作進一步的詳細說明，但不構成對本發明的限制。
[0020]在以下實施例或對比例中保證在相同用量的DNA提取的材料(即白粉菌病原體)下最后獲得可直接用于后續實驗的DNA提取液的體積相同。
[0021]實施例1
所述提取液I:包括200mM Tris-HCl、1mM C12脂肪醇醚硫酸銨、以及200mM氯化鈉的水溶液，其PH值為8.0;
所述提取液I1:包括200mM Tris-HCl和Ippm陽離子聚丙烯酰胺，其pH值為8.0。
[0022](I)收集白粉病菌的真菌菌絲體；
(2)將Img的真菌菌絲體置于500微升的提取液I中，顛倒混勻；
(3)分別在零下196°C和60° C凍融2次，即在零下196° C下冷凍，在60° C下融化；
(4)加入50微升的提取液II，顛倒混勻，放置2分鐘；
(5)10000rpm離心5分鐘去除不溶物，獲得含有真菌DNA的上清液。
[0023]實施例2
提取液1:包括150mM磷酸鈉、5mM C15脂肪醇醚硫酸銨、以及10mM氯化鈉的水溶液，其pH值為7.8;
提取液II:包括150mM磷酸鈉和3ppm陽離子聚丙烯酰胺，其pH值為7.8。
[0024](I)收集白粉病菌的真菌菌絲體；
(2)將Img的真菌菌絲體置于500微升的提取液I中，顛倒混勻；
(3)分別在零下80°C和50° C凍融3次，即在零下80° C下冷凍，在50° C下融化；
(4)加入75微升的提取液II，顛倒混勻，放置2分鐘；
(5)12000rpm離心3分鐘去除不溶物，獲得含有真菌DNA的上清液。
[0025](6)加入適量異丙醇，放置于零下30° C 30分鐘后，12000 rpm離心10分鐘，然后溶于適量的pH 8.0的TE緩沖液中。
[0026]實施例3
提取液1:包括10mM磷酸氫二鈉、5mM C15脂肪醇醚硫酸銨、以及10mM氯化鈉的水溶液，其pH值為8.2;
提取液II:包括10mM磷酸氫二鈉和3ppm陽離子聚丙烯酰胺，其pH值為8.2。
[0027](I)收集白粉病菌的真菌菌絲體；
(2)將Img的真菌菌絲體置于500微升的提取液I中，顛倒混勻；
(3)分別在零下50°C和50° C凍融2次，即在零下50° C下冷凍，在50° C下融化；
(4)加入125微升的提取液II，顛倒混勻，放置2分鐘；
(5)12000rpm離心5分鐘去除不溶物，獲得含有真菌DNA的上清液。
[0028]實施例4
提取液1:包括10mM磷酸二氫鈉、5mM C13脂肪醇醚硫酸銨、以及10mM氯化鈉的水溶液，其pH值為7.8;
提取液II:包括10mM磷酸二氫鈉和5ppm陽離子聚丙烯酰胺，其pH值為7.8。
[0029](I)收集白粉病菌的真菌菌絲體；