(2)將Img的真菌菌絲體置于500微升的提取液I中，顛倒混勻；
(3)分別在零下50°C和50° C凍融2次，即在零下50° C下冷凍，在50° C下融化；
(4)加入50微升的提取液II，顛倒混勻，放置2分鐘；
(5)12000rpm離心5分鐘去除不溶物，獲得含有真菌DNA的上清液。
[0030]實施例5
提取液1:包括10mM磷酸二氫鈉、5mM C13脂肪醇醚硫酸銨、以及10mM氯化鈉的水溶液，其pH值為7.5;
提取液I1:包括10mM磷酸二氫鈉和0.1 ppm陽離子聚丙烯酰胺，其pH值為7.5。
[0031](I)收集白粉病菌的真菌菌絲體； (2)將Img的真菌菌絲體置于500微升的提取液I中，顛倒混勻；
(3)分別在零下30°C和55° C凍融2次，即在零下50° C下冷凍，在50° C下融化；
(4)加入50微升的提取液II，顛倒混勻，放置2分鐘；
(5)12000rpm離心I分鐘去除不溶物，獲得含有真菌DNA的上清液。
[0032]實施例6
所述提取液1:包括150mM Tris-HCUlmM C18脂肪醇醚硫酸鈉、以及200mM氯化鉀的水溶液，其PH值為8.5;
所述提取液I1:包括150mM Tris-HCl和Ippm陽離子聚丙烯酰胺，其pH值為8.5。
[0033](I)收集白粉病菌的真菌菌絲體；
(2)將Img的真菌菌絲體置于500微升的提取液I中，顛倒混勻；
(3)分別在零下50°C和50° C凍融2次，即在零下50° C下冷凍，在50° C下融化；
(4)加入50微升的提取液II，顛倒混勻，放置2分鐘；
(5)12000rpm離心5分鐘去除不溶物，獲得含有真菌DNA的上清液。
[0034]對比例I
采用CTAB方法提取真菌菌絲的總DNA。
[0035](I)取保存于-20° C的真菌菌絲10mg，放于2mL離心管中，加液氮充分研磨；
(2)加入600yLCTAB提取液[2% CTAB,10mM Tris-HClCpH 8.0)，20mM EDTACpH 8.0),1.4M NaCl，使用前加2%的2-巰基乙醇]，顛倒混勻后，65° C水浴Ih;
(3)冰上冷卻至室溫，加入等體積氯仿/異戊醇(24:1)，并充分混勾，4°C，12000rpm離心1min;
(4 )吸取上清液轉入新的2mL離心管中，加入I /10體積的CTAB/NaCl溶液(10% CTAB，4.1% NaCl)，顛倒混勾，加入等體積氯仿/異戊醇(24:1)，并充分混勾，4° C，12000rpm離心1min；
(5)吸取上清液，轉入新的2ml離心管中，加入等體積CTAB沉淀液[1%CTAB，50mMTris-HCKpH 8.0)，10mM EDTACpH 8.0)]，充分混勻，65°(:水浴3011^11，4°(:，12000印111離心1011^11;
(6)吸取上清液，轉入新的1.5mL離心管中，加入0.6體積的冰凍異丙醇，充分混勻，4°C，12000rpinit^、10min;
(7)棄上清液，加入500yL70%乙醇(預冷)清洗沉淀物，干燥，加入50yL滅菌去離子水，
4。C 溶解 24h。
[0036]實施例7
在進行PCR之前，首先利用B1Photometer plus(光度適應計)核酸蛋白測定儀測定按照實施例1-6以及對比例I的方法提取的DNA的含量，測定之后發出各實施例中的DNA的含量由高到低的順序依次為:實施例1、實施例2、實施例3、實施例4、實施例5、實施例6和對比例I。
[0037]采用ITSUSEQ ID N0.1)和ITS4(SEQ ID N0.2)作為引物，實施例1-6以及對比例I提取的白粉病菌基因組DNA作為模板，進行PCR擴增并檢測結果。
[0038]50pL PCR反應體系為:模板DNA IyL,Taq酶0.5yL，上、下游引物各IyL，dNTPslyL，PCR緩沖液(含Mg2+離子)5yL，用無菌蒸饋水補充反應體系至50yL。
[0039]PCR反應程序為:94° C 預變性5 11^11;然后94°〇 30s，55。C 30s，72。C 40s，共20個循環;最后72°C延伸10 min，4°C保存。
[0040]擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(見圖1)，其中每個樣品的上樣量為2微升。
[0041 ]其中，所有引物合成均由北京六合華大基因公司完成。
[0042]通過圖1的結果可以看出，利用本發明的方法提取能夠很好擴增出所需的DNA片段，而且利用本發明的方法(實施例1-6)提取的DNA擴增出的PCR產量明顯優于對比例I，特別是實施例1-3的方法提取的DNA擴增出的PCR產量尤為量大。可見PCR擴增獲得的結果與B1Photometer plus(光度適應計)核酸蛋白測定儀測定的DNA含量獲得的結果基本一致，這進一步說明本發明的方法取得了非常好的效果，其更有利于小量樣品，甚至是微量樣品的DNA提取。同時該方法還具有操作簡單以及費時少等方面的優點。
【主權項】
1.一種真菌菌絲總DNA提取液，其包括提取液I和提取液II，其中所述提取液I包括緩沖鹽、非離子表面活性劑、以及中性鹽的水溶液，其PH值為7.5-8.5;所述提取液II包括緩沖鹽和陽離子表面活性劑，其pH值為7.5-8.5。2.根據權利要求1所述的提取液，其特征在于，所述陽離子表面活性劑為陽離子聚丙烯酰胺。3.根據權利要求1或2所述的提取液，其特征在于，所述非離子表面活性劑為醇醚硫酸鹽;優選地為脂肪醇醚硫酸銨和/或脂肪醇醚硫酸鈉;更優選地為C12?C18的脂肪醇醚硫酸銨和/或脂肪醇醚硫酸鈉;最優選地為C12?C15的脂肪醇醚硫酸銨和/或脂肪醇醚硫酸鈉。4.根據權利要求1或2所述的提取液，其特征在于，所述緩沖鹽選自Tris-HCl、磷酸鈉、磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉中的至少一種。5.根據權利要求1所述的提取液，其特征在于，所述中性鹽為氯化鹽;優選地，所述氯化鹽為氯化鈉和/或氯化鉀。6.—種提取真菌菌絲總DNA的方法，包括如下步驟: (1)收集真菌菌絲體； (2)將真菌菌絲體置于如權利要求1-5任意一項中的所述提取液I; (3)凍融至少I次，優選凍融至少2次，更優選凍融至少3次； (4)加入如權利要求1-5任意一項中的所述提取液II; (5)去除不溶物，獲得含有真菌DNA的上清液。7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，以體積計，所述提取液I與所述提取液11的比例為 10: (1-5)，優選 10:(1.5-2.5)。8.根據權利要求6或7所述的方法，其特征在于，在步驟(3)中，冷凍的溫度為零下196°C至零下20°C，融化的溫度為40°(:至70°(:;優選所述冷凍的溫度為零下196°(:，融化的溫度為50。C 至 60。C。9.根據權利要求6或7所述的方法，其特征在于，以離心的方式去除所述不溶物，優選離心速度為10000-15000 rpm，離心時間為1-5分鐘。10.根據權利要求6或7所述的方法，其特征在于，還包括步驟(6)將所述上清液中的所述真菌DNA沉淀后溶于TE緩沖液中或去離子水中。
【專利摘要】本發明屬于真菌菌絲總DNA提取的技術領域，特別涉及一種真菌菌絲總DNA提取液及提取真菌菌絲總DNA的方法。所述真菌菌絲總DNA提取液包括提取液I和提取液II，其中所述提取液I包括緩沖鹽、非離子表面活性劑、以及中性鹽的水溶液，其pH值為7.5-8.5；所述提取液II包括緩沖鹽和陽離子表面活性劑，其pH值為7.5-8.5。使用本發明的真菌菌絲總DNA提取液可以取得如下的有益效果：1）簡化了總DNA提取步驟；2）適用于總DNA微量提取，為難于稀缺的實驗材料提供了有效的實驗手段；3）避免了有毒有機溶劑的使用；4）可以簡化操作步驟和時間；5）還避免了液氮研磨過程中容易造成凍傷皮膚的可能性。
【IPC分類】C12N15/10
【公開號】CN105602941
【申請號】CN201610163675
【發明人】郭巍, 畢揚, 張艷杰, 李亞寧, 趙丹, 張汀, 劉大群, 楊寶東, 陳艷
【申請人】北京農學院
【公開日】2016年5月25日
【申請日】2016年3月20日