突變的烤煙cyp82e4基因及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種突變的烤煙CYP82E4基因，及其所編碼的蛋白質，以及其在導致煙 堿去甲基化酶的表達或功能降低中的應用。
【背景技術】
[0002] 煙草生物堿主要包括煙堿、降煙堿、新煙草堿、新煙堿，這些生物堿通過直接或者 間接亞硝化后分別生成NNK、NNN、NAT、NAB。眾多的動物試驗研究表明NNK和NNN屬于強致癌 物質，NAB和NAT僅具有較弱甚至無明顯致癌。煙草葉片在調制加工時，降煙堿發生亞硝化反 應生成的煙草特有亞硝胺（TSNA)化合物N-亞硝基降煙堿(NNN)可能引起食管癌、口腔癌 (Hecht SS Biochemistry,Bi〇l〇gy,and Carcinogenicity of Tobacco-Specific N-Nitrosamines.Chemical Research in Toxicology 1998?11:559-603；Hecht SS.Tobacco carcinogens，their biomarkers and tobacco-induced cancer.Nat Rev Cancer.2003， 3:733-744)。而且，NNN不僅是傳統煙草產品中已經明確了的有害物質，也是新型低溫煙草 制品中為數不多的已知強致癌物。
[0003] 亞硝化過程可能由葉片上的微生物完成，也可能是烘烤過程中生物堿與N0x氣體 反應產生，但均需葉片提供生物堿作為前體物質，因此，有效降低煙草中的降煙堿含量，可 降低NNN水平。
[0004] 研究發現，降煙堿是由煙堿在煙堿去甲基酶的作用下合成的，雖然煙堿向降煙堿 的轉化在煙草正常生長階段(綠葉時期）就開始了，但在收獲前降煙堿含量非常低，降煙堿 的突然大量積累發生在衰老以及采收后的調制過程。在此過程中，基因 CYP82E4表達最強， 是影響煙草制品最終降煙堿含量的主要因素。近期的研究也表明，用RNAi技術干涉CYP82E4 在煙草中表達，顯著降低了煙草降煙堿水平，NNN的含量也隨之降低（Lewis RS，Jack AM， Morris Jff,Robert VJ,Gavilano LB,Siminszky B,Bush LP,Hayes AJ,Dewey RE(2008) RNA interference(RNAi)-induced suppression of nicotine demethylase activity reduces levels of a key carcinogen in cured tobacco leaves.Plant Biotechno1 J 6:346-354)。雖然利用轉基因技術可以大幅降低煙草中的降煙堿和NNN，但目前轉基因煙草 在中國尚未通過審批。
[0005] 中國專利CN 102858983A用非轉基因方法獲得了白肋煙CYP82E4某些位點的突變， 導致白肋煙降煙堿和NNN含量降低，由于我國目前煙葉生產上90%以上種植的是烤煙，該專 利中白肋煙CYP82E4的突變位點引入到烤煙可通過與烤煙品種雜交來完成，但白肋煙與烤 煙雜交會導致烤煙品質低劣，因此目前除了創制新種質，在烤煙新品種培育過程中，要想使 白肋煙的有益性狀轉移到烤煙上而沒有其他連鎖累贅，難度要大一些。因此，雖然在白肋煙 上有一些CYP82E4突變體，但還需要在烤煙中獲得更多其他類型的CYP82E4突變體，這些突 變體來自于烤煙，具有低的降煙堿和NNN，可以實現在烤煙間低降煙堿和NNN的有效轉移和 直接的低降煙堿烤煙新品種培育。
【發明內容】
[0006] 針對上述現有技術，本發明發現了一種突變的烤煙CYP82E4基因，該突變基因可導 致煙堿去甲基化酶的表達或功能降低，從而使得含有該突變基因的煙草植株中的降煙堿含 量顯著降低，該突變基因可用于育種與選育工作:含有該突變基因的煙草植株自交，或與野 生型煙草植株雜交，可獲得降煙堿含量低的煙草品種。
[0007] 本發明是通過以下技術方案實現的：
[0008] 一種突變的烤煙CYP82E4基因，其核苷酸序列如SEQIDN0.2所示，命名為 CYP82E4-1，與野生型的CYP82E4基因（野生型的CYP82E4基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1 所示)相比較，突變位點為:第116位的核苷酸由G突變為A。
[0009] 上述突變的烤煙CYP82E4基因所編碼的蛋白質，其氨基酸序列如SEQIDN0.4所 示，與野生型的CYP82E4基因所編碼的蛋白質（野生型的CYP82E4基因所編碼的蛋白質的氨 基酸序列如SEQ ID N0.3所示)相比較，突變位點為:第39位由Gly突變為Glu。
[0010] 經研究表明，本發明的突變的烤煙CYP82E4基因，導致煙堿去甲基化酶的表達或功 能降低，從而抑制了成熟葉片內煙堿去甲基酶的活性，使得含有該突變基因的煙草植株中 的降煙堿含量顯著降低。因此，該突變的烤煙CYP82E4基因可用于篩選降煙堿含量低的煙草 品種的育種與選育工作:含有該突變基因的煙草植株自交，或與野生型煙草植株雜交，可獲 得降煙堿含量低的煙草品種。
[0011] -種獲得降煙堿含量低的煙草產品的方法，所述方法為:從煙草植物或其植物部 分中制備煙草產品，所述煙草植物或其植物部分包含有上述突變的烤煙CYP82E4基因，該突 變導致煙堿去甲基化酶的表達或功能降低。
[0012] -種降低煙草植物或其植物部分中降煙堿水平或降低煙堿向降煙堿轉變率的方 法，為：向所述植物基因組引入上述突變的烤煙CYP82E4基因。
[0013] -種鑒定具有低含量降煙堿的煙草植物的方法，所述方法為:從待鑒定的煙草植 物中提取DNA樣品，鑒別該DNA樣品中是否含有上述突變的烤煙CYP82E4基因或上述突變的 烤煙CYP82E4基因所編碼的蛋白質;若含有，則表明該待鑒定的煙草植物為具有低含量降 煙堿的煙草植物。
[0014] 優選的，所述具有低含量降煙堿的煙草植物中降煙堿的含量約占煙草植物干重的 0.04%以下。
[0015] 所述煙草植物為非轉化體。
[0016] 本發明的突變的烤煙CYP82E4基因，可導致煙堿去甲基化酶的表達或功能降低，從 而使得含有該突變基因的煙草植株中的降煙堿含量顯著降低，經研究表明，含有該突變基 因的煙草植物中的降煙堿含量可降至0.04%，與野生型煙草植物（降煙堿含量0.08%)相比 較，降低了 50 %左右。可以預料到，本發明的突變的烤煙CYP82E4基因在篩選降煙堿含量低 的煙草品種的育種與選育工作中有著廣闊的應用前景。
[0017] 本發明中所涉及的術語"低含量"、"降低降煙堿水平"等是指降煙堿在本發明植物 或其植物部分或煙草產品中的含量低于同品種煙草以相同方法加工（即培養和收獲）的煙 草屬植物或植物部分或煙草產品（未經遺傳改良）中發現的含量。降煙堿的含量可降低10 % ~50%，包括20%、30%、40%、50%。
[0018] 本發明中所述煙草植物和品種適于常規生長和收獲技術，如在富含肥料或不含肥 料的土地上培養、花套袋或不套袋、或者去頂或不去頂。收獲的葉和莖可用在任何傳統煙草 產品中，包括但不限于煙斗、雪茄煙和香煙煙草，以及任何形式的嚼煙包括葉煙、切碎煙絲 (shredded tobacco)或生切煙絲（cut tobacco)。
[0019] 本發明中所涉及的術語"煙草產品"包括但不限于吸煙材料(如任何香煙，包括小 雪茄、非通氣或通氣式過濾嘴香煙、雪茄、煙斗煙）、無煙產品（如鼻煙、嚼煙、生物可降解嵌 入物，如樹膠、錠劑、溶解條）。參見例如美國專利第2005/0019448號，該文獻通過引用納入 本文。
【附圖說明】
[0020] 圖1 :CEU酶切對異源雙鏈的酶切。
[0021 ]圖2:第二突變混合池的FA96檢測。
【具體實施方式】
[0022] 下面結合實施例對本發明作進一步的說明。
[0023] 下述實施例中所涉及的儀器、試劑、材料等，若無特別說明，均為現有技術中已有 的常規儀器、試劑、材料等，可通過正規商業途徑獲得。下述實施例中所涉及的實驗方法，檢 測方法等，若無特別說明，均為現有技術中已有的常規實驗方法，檢測方法等。
[0024] 實施例1突變的烤煙CYP82E4基因的發現與分析
[0025] (1)烤煙品種中煙100突變二代(M2)群體構建
[0026] 2012年山東諸城相州試驗農場播種中煙100 M2代2700份，每份15個單株，常規管 理至開花，每份突變材料單獨取樣，用DNA提取試劑盒提取DNA。用NONDROP測定DNA濃度并將 每份DNA濃度均一化到40ng/L，每4份DNA等量混合，構建成一個包含675個樣品的四倍混合 池，用于CYP82E4突變體篩選。
[0027] (2)CYP82E4 的 PCR 擴增
[0028] 通過⑶DDLE軟件評估突變活躍區域，在此區域內利用PRHffiR 5.0設計CYP82E4特 異引物5 ' -ATTATGCCCATCCTACAGTTACCTA-3 '，5 ' -CATTACTCATTTTTGAAAGCACCAC-3 '，進行PCR 擴增，PCR體系為PreMix 10μ1，Primer( 10μΜ)各0 · 4μ1，DNA模板（40ng/yl) ΙμL，ddH20 8 · 2μ 1，擴增程序為94°C預變性5min;94°C變性30s，52°C退火30s，72°C延伸30s，運行35個循環； 最后72°C延伸7 1^11，99°(：101^11，701€208，每個循環下降0.3°(：共70個循環。擴增片段長度為 965bp〇
[0029] (3)CEL 酶切
[0030] EMS誘變會使基因組產生G-A或者C-T的突變，該突變引起了如圖1所示的異源雙鏈 位點，CEL I能識別并切割該位點，首先構建酶異源雙鏈酶切體系：10 Xbuffer Ι