. I.le、Al.a Pro. Arg Leu 50Q 505 510： Ai.a Pro G_Lu. Leu Tyr 51.5 <2??> 4 <2Π> 517 <212> PRT <2丄3> 烤煙（Niuutiam tabhcum). ?^400> 4 Met Le.u Ser Pro· Ile : Glu Ala lie ￥al Gly Leu ￥al Thr .Fhe Thr Phe .1. 5 10 15 Leu Phe Phe Phe- Leu Trp· Thr Lys Lys Ser Gin Lys Pro Ser Lys Pro 20 25 30 l,eu Pro Pro Lys' lie Pro· Glu Gly Tr.p Pro ￥al ,I'le Gly Bis Len Phe 35 40 45 His； Ph：0 Asn Asp Asp Gly Asp Asp Arg Pro Lou Ala Arg Lys Leu &ly 50 55 6:0
[0055] Asp Leu Ala Asp. Lys Tyr Gly- Pro· Yal. Phe Thr Phe Arg Lea G,ly Leu 65 70 '75 80 Pro Leu V.al Leu Val. Val Ser Ser- Ty.r Glu Ala Yal Lys Asp .Cys Phe 85' 90 95 S.er Thr A.sn Asp M.a lie :Ph6 Ser A.s.n. Aig Pro Ala Phe Leu Tyr Gly 100 105 11:0 As:p Tyir. Leu- Gly Tyf Asn Asft 往 Met: Leu. P:h毋 Lett Ala Asn T:yr Gly 115 120' 125 Pro Tyr Trp Arg. Ly-s. Asn Arg Lys Leu Val lie. Gin G-l.u Val Leu Sei 130 135 140 Ala Ser Arg Leu Glu L>s Phe Lys HI.s Val Arg Phe Ala Arg lie Gin 145 150. 155 160 Ala. Ser lie Lys Asn Leu Tyr Thr Arg Il:e· Asp. Gly A；sn S:er Ser Thr 1.65 1T0 .175 Il.e Asn, Leu, Thr Asp Trp Leu Glu Glu Leu As.n Phe· Gly Leu- Il.e ￥a,I IgO .18.5: 190 Lys·. Met lie Ala Gly Lys Asn Tyr Glu Ser Gly L:y：·& Gly Asp. Glu Gin 195 200 205 ￥a,I Glu Arg Phe Lys Lys Als Phe Lys Asp. Phe· Met Il.e Leu" Ser Met 210 215 220 Glu Phe ￥al Leu Trp Asp Ala Phe Pro Il:e Pro： .Leu Phe· Lys. Trp Val 22.5 230 235 240
[0056] Phe Gin. Gly .His Val .Lys: Ala Me:t. Lys Arg: Tkr Phe Lys Asp Il.e 245 2 SO 2S5 A：sp Ser ￥al Phe Gin Asn Trp Leu Glu G.lu His Il.e Asn Lys. Arg Glu 260 265 270 Ly.s Met Glu. Val Asn A.l:a G.lu Gly Asn Glu Gin Asp. Phe lie Asp Vai 275 280 .285 Val: L.eti. Ser Lys Met S:ef Ash Glu Tyr Leu Gly Glu Gly Tyr Ser Arg 29Q 295. 300 Asp Thr ￥a.l lie Lys Al：a Thr Val Phe· Ser Leu Val, Leu- Asp Ala Ala 305 310 315 320 Asp Thr ￥al Ala Leu His lie ksn Trp G.ly Met Ala Leu Leu lie A：sn 325 330 335 Asxi. Gin L'y"s Ala Leu Thr -Lys Ala Glr'i Glu GIu. Tie- Asp Thr· L.yii V :al 340 345 35〇 Q.ly Lys Asp. Arg Tr.p Val. Gju Glu Ser Asp lie Lys Asp： Leu. Val Tyr 355 360 .祕 5 L：eu, Gin Ala lie ￥a'l Lys Glu Val Lm Ar.g Leu Tyr Pro Pro Gly Pro. 370 375 380 Leu Leu Va.1 Pro H.is G：lu Asn Va.l Glu .A :sp Cys Val Val S'er Gly Tyr :385 390 395 4Q0 His lie Pro. Lys Gly Thr Arg Lgu :Phe A.la Asn Val Met Lys. Leu Gin 405 410： 4.18 Arg Asp Pro Lys. Leu Xrp Ser Asp Pro Asp Thr Phe Asp Pro· Glu. Arg 420 m 430
[0057] Pk：e·- lie Ala Thr Asp lie Asp. Ph:e Arg, Gly Gin Tyr Tyr Lys Tyr lie 435 440 445 Pro. Phe G.iy. Ser Gly Arg. Ar.g Ser Cys- Pro. Gly Met 亇hr Tyr A.l.a .Leu 450 455 460 Gin Val Glu His- Leu· Thr Met Ala .His Leu lie Gin Gly Phc Asn Tyr 465: 470： 475 480 Arg Thr Pro Asn Asp Glu Pro Leu Asp Met Lys. G:lu Gly Ala lie. 485 490 495 Tkr lie Arg Lys Val Ash Pro Val G：lu Le.u lie lie Ala Pro- Arg- .Lea. 500 505 '510 A.la Fro Glu Le:u ?γχ 5.15 <210> S <2il> 25 <212> DNA <213〉 人工序列 <400> 5：
[0058] attatgccca tcctacagtt accta 25 <2i0> 6 <211> 25 <2I2> DNA <213> 人工序列 <400〉 6 cattactcat ttttgaaagc aceac 2：5
【主權項】
1. 一種突變的烤煙CYP82E4基因，其特征在于:其核苷酸序列如SEQIDN0.2所示。2. 權利要求1所述的突變的烤煙CYP82E4基因所編碼的蛋白質，其特征在于：其氨基酸 序列如SEQ ID NO.4所示。3. 權利要求1所述的突變的烤煙CYP82E4基因在篩選降煙堿含量低的煙草品種的育種 與選育工作中的應用。4. 根據權利要求3所述的應用，其特征在于:具體應用方式為:含有該突變基因的煙草 植株自交，或與其他烤煙品種雜交進行常規選育，可獲得降煙堿含量低的煙草品種。5. -種獲得煙草產品的方法，其特征在于:所述方法為:從煙草植物或其植物部分中制 備煙草產品，所述煙草植物或其植物部分包含有權利要求1所述的突變的烤煙CYP82E4基 因。6. -種降低煙草植物或其植物部分中降煙堿水平或降低煙堿向降煙堿轉變率的方法， 其特征在于:所述方法為：向所述植物基因組引入權利要求1所述的突變的烤煙CYP82E4基 因。7. -種鑒定具有低含量降煙堿的煙草植物的方法，其特征在于:所述方法為:從待鑒定 的煙草植物中提取DNA樣品，鑒別該DNA樣品中是否含有權利要求1所述的突變的烤煙 CYP82E4基因或權利要求2所述的蛋白質;若含有，則表明該待鑒定的煙草植物為具有低含 量降煙堿的煙草植物。8. 根據權利要求7所述的鑒定具有低含量降煙堿的煙草植物的方法，其特征在于:所述 具有低含量降煙堿的煙草植物中降煙堿的含量占煙草植物干重的0.04%以下。9. 根據權利要求7或8所述的鑒定具有低含量降煙堿的煙草植物的方法，其特征在于： 所述煙草植物為非轉化體。
【專利摘要】本發明公開了一種突變的烤煙CYP82E4基因，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO.2所示，與野生型的CYP82E4基因相比較，突變位點為：第116位的核苷酸由G突變為A。本發明還公開了該突變基因所編碼的蛋白質，如SEQ？ID？NO.4所示。經研究表明，本發明的突變的烤煙CYP82E4基因，導致煙堿去甲基化酶的表達或功能降低，從而抑制了成熟葉片內煙堿去甲基酶的活性，使得含有該突變基因的煙草植株中的降煙堿含量顯著降低。因此，該突變的烤煙CYP82E4基因可用于篩選降煙堿含量低的煙草品種的育種與選育工作：含有該突變基因的煙草植株自交，或與其他烤煙雜交進行常規選育，可獲得降煙堿含量低的煙草品種。
【IPC分類】A01H5/00, C12N15/29, C07K14/415, A01H1/02, C12Q1/68
【公開號】CN105602961
【申請號】CN201510761668
【發明人】李鳳霞, 劉貫山, 楊愛國, 孫玉合, 夏菲
【申請人】中國農業科學院煙草研究所
【公開日】2016年5月25日
【申請日】2015年11月10日