一種生物相容金屬有機骨架材料谷氨酸-鋅及其制備及應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于新材料技術領域，具體涉及一種生物相容金屬有機骨架材料谷氨酸-鋅及其制備及應用。
【背景技術】
[0002]金屬-有機骨架材料(MOF)固定化酶是國內外的研究熱點因為其獨特多樣的拓撲結構、孔隙度以及物理特性。金屬有機骨架材料具有多孔、大比表面積和多金屬位點等諸多性能，在氣體貯存、分子分離、催化、藥物緩釋等領域有較好的應用前景。目前金屬-有機骨架材料固定化酶常用的是封裝和物理吸附的方法將酶固定在中孔載體上，采用的有機配體大多數為傳統有機配體，但是隨著MOF在固定化酶領域研究的深入，要求MOF是由具有生物相容性的模塊構筑而成并且是環境友好型的生物相容金屬有機骨架材料(MB1F)。傳統的合成谷氨酸-鋅(Zn(L-Glu) (H2O)]出0)的方法為水熱法，采用谷氨酸與鋅鹽反應。谷氨酸是一種酸性氨基酸具有兩個羧基和一個氨基，這些官能團均可與金屬中心結合從而使得谷氨酸作為有機配體具有多種協調模式。谷氨酸與金屬離子Zn2+生成Zn(L-Glu) (H2O) ]Η20的速度取決于谷氨酸的羧基官能團與Zn2+的接觸速度。而谷氨酸在冷水和有機溶劑中的溶解度都較小且其為弱酸不易電離為-C00—，導致與Zn2+生成Zn(L-Glu)(H2O)B2O的速度非常緩慢。
【發明內容】
[0003]為了克服現有技術的不足與缺點，本發明的首要目的在于提供一種生物相容金屬有機骨架材料谷氨酸-鋅的制備方法。
[0004]本發明的另一目的在于提供上述制備方法制備得到的生物相容金屬有機骨架材料谷氨酸-鋅。
[0005]本發明的再一目的在于提供上述生物相容金屬有機骨架材料谷氨酸-鋅在酶固定化領域中的應用。
[0006]本發明的第四個目的在于提供一種固定化黑曲霉脂肪酶。
[0007]本發明的目的通過下述技術方案實現:
[0008]—種生物相容金屬有機骨架材料谷氨酸-鋅的制備方法，包含如下步驟:
[0009]將谷氨酸二鈉溶液逐滴加到含有Zn(NO3)2的甲醇中，滴加完成后離心分離并洗滌，干燥，得到生物相容金屬有機骨架材料谷氨酸-鋅(Zn(L-Glu) (H2O) ]Η20);
[0010]所述的谷氨酸二鈉溶液中的谷氨酸二鈉與Ζη(Ν03)2的摩爾比為1:(I?3);
[0011 ]所述的谷氨酸二鈉溶液與甲醇的體積比為1: (0.5?10);
[0012]所述的含有Zn(NO3)2的甲醇中Zn(NO3)2的濃度優選為0.05mol/L;
[0013]所述的干燥優選為冷凍干燥；
[0014]—種生物相容金屬有機骨架材料谷氨酸-鋅，通過上述制備方法制備得到；
[0015]所述的生物相容金屬有機骨架材料谷氨酸-鋅在酶固定化領域中的應用；
[0016]—種固定化黑曲霉脂肪酶，是將上述生物相容金屬有機骨架材料谷氨酸-鋅作為固定化載體，對黑曲霉脂肪酶進行固定化得到；
[0017]所述的固定化黑曲霉脂肪酶的制備方法，包含如下步驟:
[0018](I)將黑曲霉脂肪酶分散在pH為5?9的緩沖溶液中，得到酶溶液；
[0019](2)在10?35°C下，將EDC或EDC.HCl(1-(3-二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽)加入到步驟(I)所得的酶溶液中攪拌0.5?5h，得到混合溶液A;
[0020](3)在10?35°C下，將NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)加入到步驟(2)所得的混合溶液A中攪拌0.5?5h，得到混合溶液B;
[0021](4)將步驟(3)中所得的混合溶液B與上述載體生物相容金屬有機骨架材料谷氨酸-鋅混合，在10?35°C下攪拌固定I?12h，得到固定化黑曲霉脂肪酶；
[0022]步驟(I)中所述的黑曲霉脂肪酶優選為黑曲霉脂肪酶酶粉、胞外產黑曲霉脂肪酶或細胞破壁后含黑曲霉脂肪酶的發酵液；
[0023]步驟(I)中所述的緩沖液優選為磷酸緩沖液；
[0024]步驟(I)中所述的酶溶液的濃度優選為20mg/mL;
[0025]步驟(2)中所述的EDC或EDC.HCl與酶溶液中的黑曲霉脂肪酶的質量比為(I?3):20；
[0026]步驟(2)中所述的EDC或EDC.HCl與酶溶液中的黑曲霉脂肪酶的質量比優選為1:10；
[0027]步驟(3)中所述的NHS與酶溶液中的黑曲霉脂肪酶的質量比為(I?4): 20;
[0028]步驟(3)中所述的NHS與酶溶液中的黑曲霉脂肪酶的質量比優選為3:25;
[0029]步驟(4)中所述的混合溶液B中的黑曲霉脂肪酶與載體的質量比優選為0.5:1;
[0030]步驟(2)、(3)、(4)中所述的攪拌的速率為50?300rpm;
[0031]一種黑曲霉脂肪酶制劑，是將上述固定化黑曲霉脂肪酶冷凍干燥后得到；
[0032]本發明原理:
[0033]本發明用易溶于水的谷氨酸二鈉鹽代替谷氨酸，使羧基轉變為-C00—，然后將其與Zn2+混合，由于其均為溶液大大增加了二者的接觸機會和速度從而提高了Zn(L-Glu)(H2O)]H2O的生成速度，而甲醇的存在，更利于生成的Zn(L-Glu)(H2O) ]H20結晶從而節省大量的時間。Zn(L-Glu) (H2O) ]H20納米晶體表面含有游離的氨基，而脂肪酶蛋白中含有游離的羧基，二者較難主動脫水縮合生成酰胺鍵。通過用耦合劑H)C或EDC.HCl和NHS對酶進行修飾使得脂肪酶的羧基和Zn(L-Glu) (H2O)B2O納米晶體表面含有游離的氨基較快的發生脫水縮合反應生成酰胺鍵，從而實現脂肪酶的固定化，形成一種特定結構的固定化酶。
[0034]本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果:
[0035](I)本發明使用常溫易溶的谷氨酸二鈉代替微溶的谷氨酸作為原料，降低了反應溫度，反應條件溫和，谷氨酸-鋅晶體生成速度快，操作簡便，極大地縮短了反應時間，降低了制備Zn (L-G lu) (H2O) ]H20納米晶體的成本。
[0036](2)本發明制備方法所制備的生物相容金屬有機骨架材料谷氨酸-鋅材料晶型好、用于固定化脂肪酶載酶量高等優點。
[0037](3)本發明提供的定化黑曲霉脂肪酶的制備方法，操作簡便，反應溫和、成本較低、固定化效率高、酶的穩定性好、載酶量高，酶活回收率高。能夠用于脂肪酶、蛋白酶、環氧化物水解酶等一系列含豐富氨基的酶，并具有作為蛋白質藥物載體的潛質。
【附圖說明】
[0038]圖1是實施例1中制備的生物相容金屬有機骨架材料谷氨酸-鋅晶體冷凍干燥后的SEM 圖。
【具體實施方式】
[0039]下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。
[0040]實施例1
[0041 ] (I)將15mL含有1.8mmol的谷氨酸二鈉水溶液逐滴加入到45mL含有3mmol Zn(NO3)2的甲醇中(谷氨酸二鈉與Zn(NO3)2的摩爾比3: 5 ；谷氨酸二鈉水溶液與甲醇的體積比1: 3，含有Zn(NO3)2的甲醇中Zn(NO3)2的濃度為0.05mol/L)，立即得到白色沉淀，離心分離并洗滌后冷凍干燥，得到生物相容金屬有機骨架材料谷氨酸-鋅載體材料(Zn(L-Glu) (H2O) ]H20)(圖1);
[0042](2)將黑曲霉脂肪酶分散在pH為8的磷酸緩沖液中，得到酶溶液(20mg/mL);
[0043](3)在25°(:下，將211^細00.HCl加入到ImL酶溶液中150rpm攪拌lh，得到混合溶液A；
[0044](4)在25 0C下，將2.4mg的NHS加入到步驟(3)所得的混合溶液A中繼續攪拌Ih，得到混合溶液B;
[0045](5)取44mg步驟(I)所得的生物相容金屬有機骨架材料谷氨酸-鋅與步驟(4)中所得混合溶液B混合，在25°C下150rpm攪拌固定3.5h，得到固定化黑曲霉脂肪酶;其中，酶活回收率98.021%，該載體(生物相容金屬有機骨架材料谷氨酸-鋅)的負載量為153mg酶/g載體。
[0046]實施例2
[0047](I)將15mL含有1.5mmol谷氨酸二鈉的水溶液逐滴加入到45mL含有3mmol Zn(NO3)2的甲醇中(谷氨酸二鈉與Zn(NO3)2的摩爾比1:2;谷氨酸二鈉水溶液與甲醇的體積比1: 3，含有Zn(NO3)2的甲醇中Zn(NO3)2的濃度為0.05mol/L)，立即得到白色沉淀，離心分離并洗滌后冷凍干燥，得到生物相容金屬有機骨架材料谷氨酸-鋅載體材料(Zn(L-Glu) (H20)]H20);
[0048](2)將黑曲霉脂肪酶分散在pH為8的磷酸緩沖液中，得到酶溶液(20mg/mL);
[0049](3)在25°(:下，將211^細00.HCl加入到ImL酶溶液中150rpm攪拌lh，得到混合溶液A；
[0050](4)在25 °C下，將2.4mg的NHS加入到步驟(3)所得的混合溶液A中繼續150rpm攪拌Ih，得到混合溶液B;
[0051](5)取44mg步驟(I)所得的生物相容金屬有機骨架材料谷氨酸-鋅與步驟(4)中所得混合溶液B混合，在25°C下150rpm攪拌固定3.5h，得到固定化黑曲霉脂肪酶;其中，酶活回收率90.109%，該載體(生物相容金屬有機骨架材料谷氨酸-鋅)的負載量為123.3mg酶/g載體。
[0052]實施例3
[0053](I)將15mL含有1.0臟01谷氨酸二鈉的水溶液逐滴加