一種熒光探針及其檢測次氯酸的應用
【技術領域】
[0001] 本發明提供了一種基于花菁骨架的熒光探針Cy7-NS及其檢測次氯酸（HC10)應 用。所述探針的結構為：
[0002] 在Cy7_Cl焚光母體上引入7位引入對氨基茴香硫醚（4-Amino thioanisole)，S 作為與次氯酸的反應活性中心。這類化合物用作檢測HC10的熒光探針，其本身具有較弱的 熒光，與HC10作用后熒光發生增強，且熒光強度正比于HC10濃度，從而指示HC10的存在或 定量測定HC10的濃度。
【背景技術】
[0003] 次氯酸（H0C1)屬于一種活性氧（R0S，有十分重要的生理和病理學意義），作為 一種高效的殺菌劑，在生命的免疫系統中起到重要的作用。（文獻1 :(a)B.Halliwell，M. Whiteman,Brit. J. Pharmacol. , 2004, 142,231-255 ； (b)A.Gomes,E. Fernandes, J. L. F. C. Lima，J. Biochem. Bioph. Meth. 2005, 65, 45-80 ; (c)D. Oushiki，H. Kojima，T. Terai，M. Arita，K. Hanaoka，Y. Urano, T. Nagano, J. Am. Chem. Soc. 2010，132, 2795-2801 ; (d) K. Cui, D. Q. Zhang, G. X. Zhang, D. B. Zhu, Tetrahedron Lett. , 2010, 51, 6052-6055 ； (e) A. V. Bizyukin, L. G. Korkina, B. T. Velichkovskii, B. Exp. Biol. Med. , 1995, 119, 347-351.) 細胞內源性的次氯酸主要由白細胞（如單核細胞，嗜酸性細胞，嗜中性粒細胞等）中的髓過 氧化物酶（ΜΡ0,存在于溶酶體）/雙氧水（H202)/氯離子（C1-)系統來產生。（文獻2 : (a) D. I. Pattison，M. J. Davies，Biochemistry-Us 2006, 45, 8152-8162，(b) J. E. Harrison，J. Schultz, J. Biol. Chem. 1976, 251, 1371-1374 ； (c) Z. M. Prokopowicz, F. Arce, R. Biedron, C. L. L. Chiang, M. Ciszek, D. R. Katz, M. Nowakowska, S. Zapotoczny, J. Marcinkiewicz, B. M. Chain，J. Immunol. 2010, 184, 824-835 ; (d)Y. Koide，Y. Urano, K. Hanaoka，T. Terai，T. Nagano, J. Am. Chem. Soc. 2011，133, 5680-5682.)細胞免疫反應產生的次氯酸，若超過 一定的水平，則會引起嚴重的疾病（如關節炎，癌癥，神經退行疾病）。（文獻3 : (a) E. A. Podrez，Η. M. Abu-Soud，S. L. Hazen，Free Radical Bio. Med. 2000, 28, 1717-1725 ; (b) D. I. Pattison，M. J. Davies，Chem. Res. Toxicol. 2001，14, 1453-1464 ; (c)D. I. Pattison，M. J. Davies, Biochemistry-Us 2006, 45, 8152-8162.)
[0004] 正是因為次氯酸具有如此重要的生理和病理學意義，對次氯酸的檢測引起 了人們的廣泛重視。（文獻 4 : (a) N. Soh，Anal. Bioanal. Chem. 2006, 386, 532-543 ; (b) A. Gomes, E. Fernandes, J. L. F. C. Lima, J. Biochem. Bioph. Meth. 2005, 65, 45-80 ； (c) T. Miura, Y. Urano, K. Tanaka, T. Nagano, K. Ohkubo, S. Fukuzumi, J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 8666-8671 ; (d)Z. R. Lou，P. Li，X. F. Sun，S. Q. Yang，B. S. Wang，K. L. Han, Chem. Commun. 2013, 49, 391-393.)熒光探針是有效檢測生命體內次氯酸的 手段之一。一個具有應用前景的熒光探針應具有作用前后熒光變化明顯、對目標分 子響應快、選擇性好、合成簡單等優點。近年來，能夠應用于檢測活細胞中次氯酸的 熒光探針如雨后春筍般涌現了（文獻5 ; (a)X. Chen, K. A. Lee, Ε· M. Ha，Κ· M. Lee, Y. Y. Seo, Η. K. Choi, Η. N. Kim, M. J. Kim, C. S. Cho, S. Y. Lee, ff. J. Lee, J. Yoon, Chem. Commun. 2011, 47, 4373-4375 ； (b)G. ff. Chen, F. L. Song, J. Y. Wang, Z. G. Yang, S. G. Sun, J. L. Fan, X. X. Qiang, X. Wang, B. R. Dou, X. J. Peng, Chem. Commun. 2012, 48, 2949-2951 ; (c)L. Yuan, W. Y. Lin, J. Z. Song, Y. T. Yang, Chem. Commun. 2011，47, 12691-12693 ; (d) S. Kenmoku, Y. Urano, H. Kojima, T. Nagano, J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 7313-7318 ； (e) Z. N. Sun, F. Q. Liu, Y. Chen, P. K. H. Tam, D. Yang, Org. Lett. 2008, 10, 2171-2174 ； (f) Y. K. Yang, H. J. Cho, J. Lee, I. Shin, J. Tae, Org. Lett. 2009, 11, 859-861 ； (g) S. M. Chen, J. X. Lu, C. D. Sun, Η. M. Ma, Analyst. 2010, 135, 577-582 ； (h) X. Chen, K. A. Lee, E. M. Ha, K. M. Lee, Y. Y. Seo, Η. K. Choi, Η. N. Kim, M. J. Kim, C. S. Cho, S. Y. Lee, (i)ff. J. Lee, J. Yoon, Chem. Commun. 2011, 47, 4373-4375 ； (j)T. I. Kim, S. Park, Y. Choi, Y. Kim, Chem-Asian. J. 2011，6, 1358-1361.)但是合成響應更快，在近紅外區更長區段檢測次氯酸的熒光探針仍 具有重要意義。
【發明內容】
[0005] 本發明就是針對上述問題，提供了一種可以用于選擇性檢測次氯酸的熒光探針 Cy7-NS。這類化合物用作檢測HC10的熒光探針，其本身具有較弱的熒光，與HC10作用后熒 光發生增強，且熒光強度正比于HC10濃度，從而指示HC10的存在或定量測定HC10的濃度。
[0006] 本發明采用如下技術方案：采用七甲川花菁染料（Cy7_Cl)作為熒光母體，在花菁 母體上引入對氨基茴香硫醚（4-Amino thioanisole)使得探針能夠測定細胞內的次氯酸 (pH7. 40)中，引入的硫醚結構（-S-)作為與次氯酸反應的活性中心，與HC10發生反應，指示 HC10的存在或定量測定HC10的濃度。
[0007] 所述熒光探針的結構式如下。
[0008]
[0009] 上述結構式I表示的化合物應用于檢測HC10時，其是與HC10作用后，生成具有結 構式II的化合物，從而導致熒光改變；此過程可用于定性檢測HC10 ;
[0010]
[0011] 結構式I可對HC10定量的檢測。將濃度呈梯度變化的HC10水溶液分別加入含結 構式I的水溶液中，反應達到平衡后，分別測定各樣品的熒光強度，然后以HC10的濃度為 橫坐標、反應后體系的熒光強度為縱坐標作圖，即可根據熒光強度從圖中讀出待測溶液中 HC10的含量。
[0012] 這類化合物用作檢測HC10的熒光探針，其本身具有較弱的熒光，與HC10作用后熒 光發生增強，且熒光強度正比于HC10濃度，從而指示HC10的存在或定量測定HC10的濃度。
[0013] 本發明的有益效果：該化合物在HC10存在下熒光發生顯著增強，可用于高選擇 性、高靈敏性地定性及定量檢測HC10。這對于深入研究HC10在生物體內生理和病理過程的 動力學機理具有重要的潛在價值。
【附圖說明】
[0014] 圖1本發明提供的熒光探針檢測次氯酸的原理示意圖；
[0015] 圖2實施例1中合成的探針的1H NMR(a)，13C NMR(b)譜圖；
[0016] 圖3實施例2中熒光探針對次氯酸的選擇性示意圖；
[0017] 圖4實施例3中熒光探針溶液的紫外可見吸收光譜（a)、熒光發射光譜（b)792nm 處的熒光強度（c)隨次氯酸濃度的變化示意圖；
[0018] 圖5實施例3中pH對熒光強度的影響示意圖；
[0019] 圖6實施例3中熒光探針及其產物的耐光氧化示意圖；（熒光探針與次氯酸反應 速率的動力學示意圖）。
【具體實施方式】
[0020] 實施例用于進一步說明本發明，但本發明不限于實施例。
[0021] 實施例1 (探針的合成）：
[0022] 向50ml三口瓶中加入1.20g七甲川花菁（Cy7-Cl)，1.60g對氨基茴香硫醚 (4-Amino thioanisole)，真空氬氣置換5次，加入30ml無水DMF，開磁力攪拌，升溫至90°C， 開始反應，反應約9個小時，將濾液減壓蒸發，用二氯甲烷溶解，將所得固體經硅膠柱層析 純化（用甲醇和乙酸乙酯做洗脫劑）
[0023] 得目標化合物（熒光墨綠色固體）lHNMR(400MHz，d6-DMS0) δ (ppm) :8· 70 (s，1H) ,7. 93 (d, 2H), 7. 44 (d, J = 7. 3Hz, 2H), 7. 26 (m, 6H), 7. 12 (t, J = 7. 5Hz, 2H), 6. 89 (d, J = 8. 6Hz, 2H), 6. 04 (d, J = 14. 0Hz, 2H), 4. 08 (m, J = 7. 0Hz, 4H), 2. 6 (s, 4H), 2. 30 (s, 3H), 1. 85 (s，2H)，1.30(s，10H)，1.22(s，8H)13CNMR(d6-DMS0,500MHz)S(pp m):170.45，157.97，145· 98, 142. 74, 142. 39, 141. 28, 130. 66, 128. 91，127. 53, 124. 82, 122. 86, 117. 33, 110. 83, 98. 7 6, 48. 70, 38. 84, 28. 02, 24. 70, 21. 82, 17. 68, 12. 42
[0024] 實施例2 (探針Cy7_NS對次氯酸的選擇性）：
[0025] 先后將3400 μ L乙腈溶液、lOOuL Cy7-NS的乙腈溶液（1000 μ Μ)、6500 μ L磷酸鹽 緩沖溶液（pH = 7. 40,濃度為0. 1M)、80 μ L活性氧溶液加入到10mL比色管中，混勻后取3mL 溶液加入lcm X lcm X 4cm的比色皿中，測量該工作液的熒光發射光譜，λ ex = 750nm，光 柵寬度為5nm，5nm〇
[0026] 探針Cy7-NS對HC10的選擇性實驗結果如圖4所示，縱坐標表示波長為792nm處 的熒光強度。圖3表明Cy7-NS對HC10具有很好的選擇性，體系熒光顯著增強。測定條件 下，相比于HC10,其他活性氧（當量遠遠超過HC10)導致的熒光增強可以忽略。
[0027] 實施例3 (探針Cy7_NS對次氯酸的定量檢測）：
[0028] 先后將3400 μ L乙腈溶液、lOOuL Cy7-NS的乙腈溶液（1000 μ M)、6500 μ L磷酸鹽 緩沖溶液（pH = 7. 40,濃度為0. 1Μ)、80 μ L含不同濃度的次氯酸的溶液加入到10mL比色管 中，混勻后取3mL溶液加入lcm X lcm X 4cm的比色皿中，測量該工作液的紫外可見吸收光 譜（200-900nm)和熒光發射光譜（λ ex = 750nm，光柵寬度為5nm，5nm)。
[0029] 圖4表明該探針可以檢測人體生理水平的次氯酸。隨次氯酸加入量（0到8. 0 μ Μ) 增加吸收光譜（a)和熒光光譜（b)的變化情況，792nm處的熒光強度隨次氯酸加入量增加而 增強（c)。
[0030] 圖5說明在pH為6. 6到8. 0的生理pH條件下，Cy7-NS的熒光在次氯酸作用下可 以顯著增強，pH對該探針的影響十分有限。
[0031] 圖6說明在實驗條件下，探針本身或者探針與次氯酸作用后得到的產物均耐光氧 化。（表明Cy7_NS與次氯酸的反應十分迅速）。
【主權項】
1. 一種巧光探針，其特征在于，所述的巧光探針的結構為： 結構I。2. -種權利要求1所述的巧光探針在檢測HClO中的應用，其特征在于，將結構I表示 的化合物應用于檢測HClO時，其是與HClO作用，生成具有結構II的化合物，從而導致巧光 的改變；此過程可定性檢測肥10 ; 結構II。3. 根據權利要求2所述的巧光探針在檢測HClO中的應用，其特征在于，所述探針的巧 光強度正比于肥10的濃度；該過程可用于肥10的定性或定量檢測。
【專利摘要】本發明涉及一種基于花菁骨架的熒光探針及其檢測次氯酸(HClO)的應用。所述探針的結構為：這類化合物用作檢測HClO的熒光探針，其本身具有較弱的熒光，與HClO作用后熒光發生增強，且熒光強度正比于HClO濃度，從而指示HClO的存在或定量測定HClO的濃度。
【IPC分類】C07D209/14, C09K11/06, G01N21/64
【公開號】CN105646325
【申請號】
【發明人】韓克利, 張亞楠, 李鵬, 曲宗金
【申請人】中國科學院大連化學物理研究所
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2014年12月2日