一株分解酸性土壤難溶性磷酸鋁的微紫青霉菌及其應用
【技術領域】
[000? ]本發明屬于土壤修復和生物技術領域，具體涉及一株微紫青霉菌(Penici 1 lium janthinellum)PA01及其對難溶性磷酸錯的溶解作用，可應用于溶解酸性土壤難溶性磷。 技術背景
[0002] 磷對植物生長發育發揮著重要作用，但土壤中絕大部分的磷不能被植物直接吸 收。據調查，全國有74%的耕地土壤缺磷，為滿足生產需要，我國絕大部分農田需大量施用 磷肥，而施入的磷肥當季利用率僅為5%-25%，大部分磷與土壤中的Ca 2+、Fe3+、Al3+等結合， 形成難溶性磷酸鹽，無法被植物吸收利用，其中酸性土壤中主要以Al-P、Fe-P形式存在。因 此，如何使酸性土壤中的難溶性磷酸鋁在一定程度上發生溶解，提高其植物有效性，保證較 高的磷肥利用率一直是環境工程、植物營養與資源利用領域的研究熱點。
[0003] 大量研究證明，影響土壤中磷利用率的因素很多，其中微生物對土壤中磷的利用 率影響最大，解磷微生物能夠使難溶性磷轉化成為有效磷，供植物體吸收利用。具有解磷作 用的微生物種類很多，也比較復雜。目前報道具有解磷作用的微生物包括解磷細菌類、解磷 真菌類和放線菌類，其中解磷細菌類數量相對較多，而解磷真菌在數量上遠不如解磷細菌 多，其種類也少，主要局限于青霉(PeniciIlium)、曲霉(Aspergillus)、鐮刀菌（Fusarium)、 小絲核菌(Sclerotium)等幾個屬種，但其解磷能力通常比細菌強，且解磷真菌遺傳較穩定， 一般不易失去解磷功能。微紫青霉菌作為青霉屬的一種，目前鮮有關于其解磷能力尤其是 對酸性土壤難溶性磷溶解能力的報道。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是為解決現有技術問題，提供了一種對酸性土壤難溶性磷酸鋁具有 高效溶解能力的微紫青霉菌菌株及其應用。本發明還提供一種分解酸性土壤難溶性磷酸鋁 的方法和微生物菌劑。
[0005] 本發明是這樣實現的：
[0006] 首先利用難溶性磷酸鋁篩選培養基從養豬場水泡糞沼渣中篩選得到一株真菌，申 請人將其命名為微紫青霉菌（Penicillium janthinellum)PA01，并于2015年12月15日送交 湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心（CCTCC)保藏，其保藏號為：CCTCC N0：M2015757〇
[0007] 隨后采用恒溫振蕩培養的方式檢測微紫青霉菌PA01對難溶性磷酸鹽(A1P04)的溶 解作用，具體方法是:采用上述微紫青霉PA01菌株，擴增培養后得到孢子液，將孢子液按1 % 的接種量接種到含磷酸鋁(AlP04,5g/L)的液體培養基中，于30°C、180rpm振蕩培養15天，培 養液中可溶性磷含量可達289.7mg/L，解磷效果明顯。
[0008] 微紫青霉菌PA01對酸性土壤，尤其是pH為3~7的酸性土壤中的難溶性磷具有較強 的解磷能力，并且在25~35°C溫度范圍內的解磷能力最強。因此可將該菌株擴增培養后用 于分解酸性土壤中的難溶性磷，也可以微紫青霉菌PA01為活性成分，制備用于分解酸性土 壤難溶性磷的微生物菌劑。
[0009]本發明所提供的菌株豐富了野生解磷菌遺傳資源，擴大了解磷菌全基因組育種的 后備庫。該菌能提尚酸性土壤中有效憐的含量，提尚憐肥利用效率，提尚農作物廣量，減少 水土流失，具有廣闊的應用前景。
[0010]更詳盡的技術方案見《【具體實施方式】》所述。
【附圖說明】
[0011] 圖1:菌株PA01~06的15d最大溶磷量比較。
[0012 ]圖2:不同溫度對菌株ΡΑ01溶磷能力的影響。
[0013] 圖3:不同初始pH對菌株PA01溶磷能力的影響。
【具體實施方式】
[0014] 以下是結合附圖和實施例對本發明作的進一步闡述。需要說明的是，本發明的實 施例對于本發明只有說明作用，而沒有限制作用。本發明中所涉及的各種實驗操作，均為本 領域的常規技術，文中沒有特別說明的部分，本領域的普通技術人員可以參照本發明申請 日之前的各種常用工具書、科技文獻或相關的說明書、手冊等加以實施。
[0015] 本發明所涉及的培養基配方如下：
[0016] 難溶性磷酸鋁固體培養基：葡萄糖 10g，（NH4)2S〇4 0.5g，MgS〇4 · 7H20 0.3g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，FeS〇4.7H20 0.03g，MnS〇4.H20 0.03g，AlP〇4 5g，蒸餾水 1000mL，pH7.0~ 7.2，瓊脂20841卩〇4與其他藥品分開滅菌后混合。
[0017]難溶性磷酸鋁液體培養基：葡萄糖 l〇g，（NH4)2S〇4 0.5g，MgS〇4,7H20 0.3g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，FeS〇4.7H20 0.03g，MnS〇4.H20 0.03g，AlP〇4 5g，蒸餾水 1000mL，pH7.0~ 7.2，Α1Ρ〇4與其他藥品分開滅菌后混合。
[0018]實施例1解磷微生物的初步篩選
[0019]稱取10g武漢市天健農業發展有限公司生豬養殖場提供的水泡糞沼渣于裝有90mL 無菌生理鹽水的三角瓶中，在28°C恒溫搖床上180r/min恒溫振蕩30min，使樣品均勾分散于 蒸餾水中，靜置20分鐘后取上清液，得到稀釋倍數為ΠΓ 1菌懸液，依次稀釋得到10-3、10-5、 1 0-7倍稀釋度的菌懸液，分別取各濃度梯度的菌懸液〇. lml均勻地涂布在含磷酸鋁固體培養 基上(A1P04，5g/L)，每個濃度作3個重復，放入恒溫培養箱中，在30°C恒溫條件下培養5~7d 后。觀察培養基上長出的菌落，選出菌落周圍產生明顯的顏色變化并有透明圈的菌株，依次 命名為ΡΑ01、ΡΑ0 2、ΡΑ0 3、PA04、ΡΑ0 5、PA06。
[0020]實施例2解磷微生物的復篩
[0021]將初篩得到的菌株分別接種到100mL含磷酸鋁的無機磷液體培養基中(AlP04,5g/ L)，30°C，180rpm，培養15天，同時以不加任何菌的液體解磷培養基作為對照組。將培養液以 5000r/min離心10min后，取上清液，稀釋到合適濃度，通過鉬鋪抗比色法測定可溶性磷含 量。結果如圖1所示，本發明篩選到的上述6株菌均具有一定的解磷效果，能將培養基中的難 溶磷(A1P04)分解成溶解性磷，其中PA01菌株的解磷效率最高，溶解性磷含量高達289.7mg/ L。因此，該菌株可做成解磷菌劑，可廣泛應用于農業生產中。
[0022] 實施例3菌株PA01的鑒定
[0023] (1)菌株?六01的菌落形態
[0024] 菌落為白色，質地絨狀，邊緣圓形、整齊;菌落背面無色或中央略帶黃色。菌落正面 有大量的分生孢子，有淺黃色滲出液;菌叢呈白色，菌絲發達，分生孢子梗呈管狀，其上產生 分生孢子，分生孢子為圓形。
[0025] (2)菌株PA01的分子生物學鑒定
[0026]采用分子生物學方法對上述篩選得到的PA01菌株進行鑒定，將該菌株的18SrDNA ITS序列通過PCR擴增，獲得600bp左右長度的擴增產物，擴增產物經測序公司進行序列測 定，將所測序列與GenBank數據庫中的序列進行BLAST比對，結果表明，該菌株與微紫青霉菌 (卩611；[(3；[11;[11111」3111:11；[1161111111)的相似度為99%以上。結合形態特征、培養特征及183抑嫩 ITS序列分析，該菌株確定為微紫青霉菌(Penicillium janthinellum) 0
[0027]實施例4不同培養溫度對菌株PA01解磷能力的影響
[0028]先將上述菌株PA01接種到TOA固體培養基上，28°C培養5~7天，待已產生大量孢子 后，用適量無菌水洗下，并用無菌水將孢子液濃度調節至2 X 109CFU/ml，4°C存儲備用。接種 lmL孢子液到裝有100ml難溶性磷酸鋁液體培養基的250ml三角瓶中，以加入相同體積的難 溶性磷酸鋁液體培養基不接種為對照（CK)。分別于25°C、28°C、30°C、35°C五個溫度下， 180r/min振蕩培養7天，每個處理三瓶重復，每天取樣測定培養中可溶性磷含量及pH值。結 果如圖2所示。
[0029]由圖2可以看出，菌株PA01在25~35°C之間都具有很好的適應性，并且具有較強的 解磷能力。在30°C時解磷效果最好，最大溶磷量為235.32mg/L。最大溶磷量大小依次為30°C >28°C>25°C>35°C。各溫度下培養液pH變化與溶磷量變化呈現顯著負相關性，隨著pH下降， 溶磷量逐漸升高，在pH降至最低值時，溶磷量達到最高值。
[0030]實施例5不同初始pH對菌株ΡΑ01解磷能力的影響
[0031]實驗方法與實施例4相同，分別調節培養液初始pH值為3.0、5.0、7.0、9.0，于30°C， 180r/min振蕩培養7天。以加入相同體積的難溶性磷酸鋁液體培養基不接種為對照(CK)，每 個處理三瓶重復，每天取樣測定培養中可溶性磷含量及pH值。結果如圖3所示。
[0032]由圖3可以看出，菌株PA01在pH3~7范圍內都具有很強的適應性，并且具有較強的 解磷能力。在pH值為9時，PA01溶磷能力較弱。在pH值為3時溶磷量最高，影響最大溶磷量大 小的培養液初始pH值依次為pH3>pH5>pH7>pH9。說明菌株ΡΑ01能很好適應偏酸性環境。如今 后接種于酸性土壤，將對其難溶性磷具有很好的溶解能力。
【主權項】
1. 一株分解酸性土壤難溶性磷酸錯的微紫青霉菌(Penicillium janthinellum)PA01， 保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC N0:M2015757。2. 權利要求1所述的微紫青霉菌PA01在分解酸性土壤難溶性磷酸鋁中的應用。3. -種分解酸性土壤難溶性磷酸鋁的方法，其特征在于:采用權利要求1所述的微紫青 霉菌PA01，擴增培養后得到孢子液，然后將孢子液接種至酸性土壤中。4. 一種分解酸性土壤難溶性磷酸鋁的微生物菌劑，其活性成分是權利要求1所述的微 紫青霉菌PA01。
【專利摘要】本發明公開了一株分解酸性土壤難溶性磷酸鋁的微紫青霉菌(Penicillium？janthinellum)PA01，保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC？NO：M2015757。本發明所提供的菌株豐富了野生解磷菌遺傳資源，擴大了解磷菌全基因組育種的后備庫，該菌能提高酸性土壤中有效磷的含量，提高磷肥利用效率，提高農作物產量，減少水土流失，具有廣闊的應用前景。CCTCC NO：M201575720151215
【IPC分類】C12N1/14, C09K17/14, C12R1/80, C09K109/00
【公開號】CN105647817
【申請號】
【發明人】朱端衛, 李震宇, 肖乃東, 周洋, 肖雪, 周文兵, 蔡建波, 趙建偉, 萬小瓊, 劉廣龍, 華玉妹
【申請人】華中農業大學
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年1月26日