方程為y = -16.40713+1059.60431x，R = 0.99758。菌株NSW-V發酵液提取物 出峰時間8.802min(圖1，b)，二者出峰時間接近，當向菌株NSW-V發酵液提取物中添加標準 品后HPLC出峰時間重疊，結果表明NSW-V發酵液提取液中存在石杉堿甲，發酵液中產石杉堿 甲含量為32mg/100ml。
[0037] (四）具有治療阿爾茨海默病功能的真菌菌株分子生物學鑒定
[0038] 1.基因組DNA提取
[0039]按照Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒進行。
[0040] 1)取50-100mg新鮮真菌或菌絲用液氮研磨成粉末，加入1.5ml離心管中。加入200μ 1 Buffer Digestion和2μ1β_疏基乙醇，再加入20μ1 Proteinase Κ溶液，震蕩混勾。56°C水 浴lh質細胞完全裂解。
[0041 ] 2)加入100μΙ Buffer PF，充分顛倒混勻，-20°c冰箱放置5min。
[0042] 3)室溫lOOOOrpm離心5min，將上清液轉移到新的1.5ml離心管中。
[0043] 4)加入200μ1 Buffer BD，充分顛倒混勻。
[0044] 5)加入200μ1無水乙醇，充分顛倒混勻。
[0045] 6)將吸附柱放入收集管中，用移液器將溶液和半透明纖維狀懸浮物全部加入吸附 柱中，靜置2min，再lOOOOrpm室溫離心lmin，倒掉收集管中的廢液。
[0046] 7)將吸附柱放回收集管，加入500μ1 PW Solution，10000rpm離心30s倒掉收集管 中的廢液。
[0047] 8)將吸附柱放回收集管，加入500μ1 Wash Solution，10000rpm離心30s倒掉收集 管中的廢液。
[0048] 9)將吸附柱重新放回收集管中，于12000rpm離心2min，離去殘留的Wash Solution。
[0049] 10)取出吸附柱，放入一個新的1.5ml離心管中，加入50μ1 TE Buffer靜置3min， 12000rpm室溫離心2min，收集DNA溶液。提取的DNA可立即進行下一步實驗。
[0050] 2.PCR 擴增
[00511 2.1真菌菌種鑒定通用引物：
[0052]
[0053] 2.2PCR 反應體系：
[0054]
[0055] 2.3PCR循環條件
[0056]
[0057] 3、凝膠電泳
[0058] 電泳條件：1 %瓊脂糖電泳，150V、100mA、20min，電泳方向從上往下。電泳PCR產物 結果（圖2，a)，Marker條帶堿基對大小（圖2，b)，其中，左側圖中第一條帶為菌株NSW-V檢測 區，第二條帶為Marker檢測區。結果顯示：目的檢測菌株NSW-V菌株DNA擴增條帶經瓊脂糖凝 膠電泳測定大小約為500_600bp，且上下無雜帶。
[0059] 4、PCR產物結果鑒定，委托生工生物工程(上海股份有限公司）進行測序。
[0060] 根據blast結果，菌株NSW-V與Trichoderma harzianum親源關系最近。
[0061]本發明具有治療阿爾茨海默病功能的真菌菌株具有下述特征：
[0062] 1.鏡下形態特征
[0063]如圖3所示，本發明具有治療阿爾茨海默病功能的真菌菌株，屬于哈茨木霉 (Trichoderma harzianum)NSW_V株，菌絲纖細無色，具分隔，多分枝。分生孢子梗從菌絲的 側枝上生出，對生或互生，一般有2-3次分枝，著生分生孢子的小梗瓶形或錐形。分生孢子多 為球形，孢壁具小疣突，藍綠色。
[0064] 2.在真菌用PDA培養基上的特征：
[0065] 該真菌菌株在PDA培養基上菌落初為白絮狀，后為暗綠色。
[0066] 3.該真菌菌株高效表達石杉堿甲培養條件為：
[0067] (1)培養基：采用PDA液體培養基。具體配方為：馬鈴薯300g，葡萄糖20g，蒸餾水 1000ml〇
[0068] (2)培養條件：28°C，220r/min。
[0069] (3)裝液量:250ml錐形瓶，裝液量為100ml。
[0070] (4)培養時間：5天。
[0071 ]本發明真菌菌株，歸屬于木霉屬真菌，經液體發酵培養提取代謝產物，可獲得較高 產量石杉堿甲。
[0072]本發明真菌菌株的ITS與同屬的相同種的比對結果(相似度為100%)。
[0073] 與Trichoderma harzianum strain BHR2P1F3M的相似度為100% ;
[0074] 與Trichoderma harzianum strain BHR1P1F2M的相似度為100% ;
[0075] 與Trichoderma harzianum voucher TriH_JSB301 的相似度為100% ;
[0076] 與Trichoderma harzianum voucher TriH_JSB22的相似度為100%。
[0077] 該屬鮮有報道具有產石杉堿甲能力。通過對其機理研究，可以進一步加深菌株產 石杉堿甲中高效表達基因的研究，從而構建新的轉基因生物，使其獲得更高效的表達。本發 明真菌菌株NSW-V株作為新的產石杉堿甲菌株，將為生物合成途徑合成石杉堿甲提供新的 菌種資源。
【主權項】
1. 一種具有治療阿爾茨海默病功能的真菌菌株，其特征在于，該菌株為從野生蛇足石 杉(Huperzia serrata石杉科，石杉屬）內生真菌中分離獲得，屬于木霉屬哈茨木霉菌種 (Trichoderma harzianum)NSW-V株，在實驗室傳代15代后具有遺傳穩定性，其氨基序列如 SEQ ID N0:1 所示。2. 根據權利要求1所述的具有治療阿爾茨海默病功能的真菌菌株，其特征在于，該真菌 菌株高效表達石杉堿甲培養條件為： (1) 培養基:采用PDA液體培養基，具體配方為：馬鈴薯300g，葡萄糖20g，蒸餾水1000ml; (2) 培養條件:28 °C，220r/min; (3) 裝液量:250ml錐形瓶，裝液量為100ml; (4) 培養時間:5天。3. 根據權利要求1所述的具有治療阿爾茨海默病功能的真菌菌株，其特征在于，該真菌 菌株高效穩定性表達石杉堿甲時，該菌株的實驗室保存條件為：（1)菌株每次在TOA固體斜 面傳代后，生長時間為72h;(2)保存菌種條件為4°C，12h后在將其放置-25°C冰箱中進行保 存。4. 一種高效表達石杉堿甲并作為治療阿爾茨海默病的功能菌株在生物合成制藥方面 的應用。5. -種具有治療阿爾茨海默病功能的真菌菌株的應用，其特征在于，通過轉基因、誘變 育種對真菌菌株進行基因改造，以獲得表達效率更高、遺傳穩定性更好的系列菌株。
【專利摘要】本發明公開了一種具有治療阿爾茨海默病功能的真菌菌株，該菌株為從野生蛇足石杉內生真菌中分離獲得，屬于木霉屬哈茨木霉菌種(Trichoderma？harzianum)NSW-V株，在實驗室傳代15代后具有遺傳穩定性，其氨基序列如SEQ？ID？NO：1所示。本發明具有治療阿爾茨海默病功能的真菌菌株，作為治療阿爾茨海默病的生物菌株，將其優良的產石杉堿甲高效表達基因轉入其他模式菌株中，通過基因改造獲得更多的優良性狀，此外還可通過誘變育種達到菌株的進一步優化。對其研究將會為生物合成工業化生產石杉堿甲，保護植物資源、解決臨床一線用藥需求、降低治療阿爾茨海默病醫藥費用有著巨大意義。CGMCC No.1207620160115
【IPC分類】C12R1/885, A61K36/06, A61P25/28, C12N1/14
【公開號】CN105647819
【申請號】
【發明人】韓文霞, 李偉澤, 韓忠文, 張寒, 孫靜, 李妮, 王琳, 周永強
【申請人】西安醫學院
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年3月2日