一株瑞氏木霉工程菌CstrxR1及其構建方法和應用
【技術領域】
[0001 ]本發明屬于工程菌技術領域，具體涉及一株瑞氏木霉工程菌CstrxRl及其應用。
【背景技術】
[0002]纖維素酶是能將纖維素降解為葡萄糖單體的一組酶系的總稱，通常包括內切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶和葡萄糖苷酶。纖維素酶資源對于可持續利用生物質資源具有重要意義，可廣泛應用于生物能源、飼料、洗滌、造紙及植物源活性物質制備等領域。瑞氏木霉(Trichoderma reesei)能夠產生完整的纖維素酶系，是工業生產纖維素酶的重要菌株。當前，傳統的誘變育種技術難以繼續提升瑞氏木霉產纖維素酶的能力。借助基因工程手段改良瑞氏木霉的纖維素酶產生能力，成為降低纖維素酶生產成本的有效途徑。
[0003]絲狀真菌的細胞氧化還原狀態能夠控制許多重要基因的表達調控。硫氧還蛋白系統(th1redoxin system)是存在于絕大多數生物體中的一類抗氧化系統，具有調控細胞氧化還原平衡等多種重要功能。硫氧還蛋白從氧化態轉化成還原態依賴于硫氧還蛋白還原酶(th1redoxin reductase，TrxR)的催化作用。因而，TrxR對于胞內的氧化還原平衡或某些蛋白分子的氧化還原狀態具有重要的調控作用。瑞氏木霉細胞中具有高水平的TrxR會極大的改變其細胞氧化還原狀態，進而增強相關蛋白(如纖維素酶)分子的基因表達。
【發明內容】
[0004]發明目的:針對現有技術中存在的不足，本發明的目的是提供一株瑞氏木霉工程菌CstrxRl，能高產纖維素酶。本發明的另一目的是提供上述瑞氏木霉工程菌CstrxRl的構建方法。
[0005]技術方案，為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案為:
一株瑞氏木霉工程菌CstrxRl，分類名稱為瑞氏木霉Trichoderma reesei CstrxRl，保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏日期為:2016年3月I日，保藏編號為CCTCC NO:M2016078，保藏地址為:中國湖北武漢武漢大學。
[0006]在所述的瑞氏木霉工程菌CstrxRl中克隆有來自于蟲擬錯菌的硫氧還蛋白還原酶基因序列，該基因序列如SEQ ID N0.1所示。
[0007]構建所述瑞氏木霉工程菌CstrxRl的方法:將序列如SEQ ID N0.1所示的DNA片段通過質粒pAgl-CstrxRl導入瑞氏木霉基因組，所述質粒口六81-081:^1?1是在質粒。481-!13的KpnI和ApaI位點順序裝入瑞氏木霉纖維二糖水解酶I啟動子序列Pcbhl、序列如SEQ IDN0.1所示的DNA片段和瑞氏木霉纖維二糖水解酶I終止序列Tcbhl。
[0008]所述瑞氏木霉為瑞氏木霉D-86271。
[0009]所述的瑞氏木霉工程菌CstrxRl在產纖維素酶中的應用。
[0010]有益效果:與現有技術相比，本發明成功構建出瑞氏木霉工程菌CstrxRl，通過實驗證明高表達蟲擬蠟菌中硫氧還蛋白還原酶編碼基因的瑞氏木霉工程菌，其纖維素酶產量(濾紙酶活)與親本瑞氏木霉相比提高0.78倍。本發明對工業生產中提高纖維素酶生產效率具有重要的應用價值。
【附圖說明】
[0011]圖1是表達質粒pAgl-CstrxRl的圖；
圖2是基因CstrxRl大腸桿菌重組表達SDS-PAGE電泳檢測圖；
圖3是CstrxRl基因瑞氏木霉轉化株的鑒定圖；
圖4是固態發酵條件下瑞氏木霉基因工程菌株纖維素酶產量的比較圖;D-86271為未轉化親本菌株，CstrxRl為瑞氏木霉基因工程菌，CK為含空載體的瑞氏木霉轉化菌株；
圖5是固態發酵條件下瑞氏木霉基因工程菌株胞外蛋白的比較結果圖;D-86271為未轉化親本菌株，CstrxRl為瑞氏木霉基因工程菌，CK為含空載體的瑞氏木霉轉化菌株；
圖6是固態發酵條件下瑞氏木霉基因工程菌株生物量的比較結果圖;D-86271為未轉化親本菌株，CstrxRl為瑞氏木霉基因工程菌；
圖7是瑞氏木霉基因工程菌株發酵培養過程中纖維素酶合成基因的相對表達量結果圖；其中，D-86271為未轉化親本菌株，CstrxRl為瑞氏木霉基因工程菌。
【具體實施方式】
[0012]下面結合具體實施例對本發明做進一步的說明。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0013]實施例1基因表達載體pAgl-CstrxRl的構建
1、蟲擬錯菌硫氧還蛋白還原酶編碼基因CstrxRl的獲得及E.coli表達分析蟲擬錯菌(Ceripor1sis subvermispora B)的全基因組序列(GenBank號:AE0V00000000.1)，獲得一個候選的硫氧還蛋白還原酶蛋白編碼基因CstrxRl。采用TrizoI試劑分離蟲擬錯菌(Ceripor1psis subvermispora)FP-105752-Sp (由Forest ProductsLaboratoryCCentre for Forest Mycology Research) , Madison, WI, USA提供)的總RNA，并以反轉錄試劑盒(TransGen，北京)進行cDNA第一鏈的合成(oligo(dT)引物)，并作為模板以引物CstrxR_fl (含NdeI識別序列和保護堿基)和CstrxR_rl(含HindIII識別序列和保護堿基)擴增獲得CsTrxRl的cDNA片段。將獲得的cDNA片段克隆到載體pEASY-Blunt(TransGen，北京)，并由上海英駿生物技術公司進行測序分析(Invitrogen,上海)，經測序驗證正確，其序列如SEQ ID N0.1所示，推測得出對應的蛋白序列如SEQ ID N0.2所示。各引物的序列如下:
CstrxR_fI:57-gctctagacatatgatggcacccctcacgaatg-37 ；
CstrxR_rl:57-cgaagcttatcttcgataccctcttcctc-37。
[0014]對CstrxRl基因的cDNA片段進行Ndel/HindllI雙酶切，并連接入大腸桿菌(E.coli)表達載體pET23b(Novagen，Germany)的相應位點，獲得質粒pET-CstrxRl。根據產品操作說明，將pET-CstrxRl轉入大腸桿菌表達菌株(E.coli )Rosseta菌株(TransGen，北京)，并以異丙基-1-硫代β-D吡喃型半乳糖(IPTG)進行誘導表達。借助表達的CstrxRl重組蛋白具有C端融合的組氨酸標簽，對其進行His.Bind柱(Novagen，Germany)純化，并進行SDS-PAGE電泳檢測(如圖1所示)。圖1顯示，獲得的重組Cs trxRI分子大小與理論分子量(38.4kD，包括His標簽)相符。
[0015]2、構建瑞氏木霉基因表達質粒pAgl-CstoxRl
以瑞氏木霉(Trichoderma reesei )D-86271 (=Rut_C30)(購買于 VTT culturecenter ,Finland)基因組DNA為模板，在高保真酶(Fastpfu)作用下，以引物Tcbhl—f (含XhoI識別序列和保護堿基VTcbhl—K含ApaI識別序列和保護堿基)擴增獲得長1088 bp的纖維二糖水解酶 I 終止序列(Tcbhl)，并將其插入 pAgl-H3(Zhang，A.，Lu，P.，Dahl-Roshak,A.M., Paress, P.S., Kennedy , S., Tkacz, J.S., An，Z., 2003.Efficientdisrupt1n of a polyketide synthase gene (pksI) required for melaninsynthesis through Agrobacterium-mediated transformat1n of Glarea lozoyensis.Mol Gen Genomics 268，645-655.)的Xhol/Apal位點，獲得質粒 pAgl-Tcbhl。同時，以瑞氏木霉(Trichoderma reesei) D-86271基因組DNA為模板，以引物Pcbhl—f/Pcbhl—r擴增獲得891 bp纖維二糖水解酶I啟動子序列(Pcbhlh以質粒pET-CstrxRl為模板，以引物CstrxR_f2/CstrxR_r2 擴增獲得 CstrxRl 基因序列。通過Hieff CloneTM One Step Pcr克隆試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司，上海)將以上獲得的Pcbhl和CstrxRl基因序列同源重組方式克隆到質粒pAg-Tcbhl(經過KpnI/XhoI雙酶切)，產生質粒pAgl_CstrxRl。基因表達質粒pAgl- CstrxRl的物理圖譜如圖2所示。各引物序列如下:
CstrxR—f2:57-catgtctagaatggcacccctcacgaatg-37 ；
CstrxR_r2:57-ctttcgcacggagctctcgagctagtggtggtggtggtggtgctc-37 ；
Pcbhl—f:57-agtgaattcgagctcggtaccgatagcagtgtctagtagca-37 ；
Pcbhl—r:57-tgaggggtgccattctagacatgatgccagtccgcggttg-37 ；
Tcbhl—f:57-gactcgagagctccgtgcgaaagcctgacgca-37 ；
Tcbhl—r:57-ctgggcccatcgtaaccgagaatccagagctg-37 0
[0016]實施例2構建表達CstoxRl基因的瑞氏木霉基因工程菌株
1、基因表達質粒pAgl-CstrxRl轉化根癌農桿菌
取I Ug質粒pAgl-CstrxRl的DNA加入根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)AGL_l(Mullins , E.D., Chen, X., Romaine, P., Raina, R., Geiserj D.M., Kang, S.,2001.Agrobacterium-mediated transformat1n of Fusarium oxysporum: anefficient tool for insert1nal mutagenesis and gene transfer.Phytopathology.91: 173-180.)的感受態細胞中混勻，放入液氮中5分鐘。取出，立即在42 °C熱激2分鐘后加入700 uL LB液體培養基，28 °(:振蕩培養2小時。將菌液均勻涂布在含有75 ug/ml卡那霉素的LB瓊脂平板上，28 °(:倒置培養2天，得到含有重組質粒pAgl-CstrxRl的根癌農桿菌單菌落。
[0017]2、根癌農桿菌介導的遺傳轉化及菌株的初步抗性篩選
將獲得的含有重組質粒PAgl-CstrxRl的根癌農桿菌單菌落接種于5 mL MM液體培養基中，28 °(:振蕩培養2天。用IM培養基將菌體稀釋到0D6Q()=0.15，28 °(:振蕩培養6小時，至OD600=0.6。取100 UL菌液與等體積的瑞氏木霉(Trichoderma reesei)D_86271孢子懸液混合(懸液濃度=2 X 16個孢子/mL)，均勻涂布在CM瓊脂平板(鋪有玻璃紙)上，24 °C正置共培養3天。將共培養菌體轉接至含有75 yg/mL潮霉素B和400 yg/mL噻孢霉素鈉的TOA瓊脂平板上，28 °(:倒置培養4-5天至含有潮霉素B抗性基因的轉化子長出。
[0018]3、PCR篩選表達Cs trxRl基因的瑞氏木霉基因工程菌株
將獲得的潮霉素B抗性的轉化子接種于Mandels培養基(以1%乳糖作為碳源)，28 °C、180 rmp振蕩培養2天。根據前述方法提取其總DNA和RNA后，分別進行如下PCR和RT-PCR反應:
PCR(圖3A):根據h