一株過表達來源于寄生疫霉的ω-3脫飽和酶的重組高山被孢霉、其構建方法及應用
【專利說明】一株過表達來源于寄生疫霉的ω -3脫飽和酶的重組高山被孢 霉、其構建方法及應用 【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因工程領域，特別涉及一株過表達來源于寄生疫霉的ω-3脫飽和酶 〇PpFADS17基因的高山被孢霉，還涉及其構建方法及用途。 【【背景技術】】
[0002] 高山被孢霉(Mortierella alpina)是一種脂質積累可以達到細胞干重50%的產 油真菌，是脂質生物化學基礎研究的重要模式生物。高山被孢霉已經被應用于工業化生產 花生四稀酸(Arachidonic acid，AA，C20:4)，其生產的食用油脂已經通過美國食品藥品監 督管理局(FDA)的安全性評估。除了合成AA之外，高山被孢霉也具有一定的合成二十碳五烯 酸(Eicosapentanoic acid，EPA，C20 : 5)的能力。EPA屬于ω -3長鏈多不飽和脂肪酸（LC-PUFAs)，具有重要的生理功能，如：促進哺乳動物大腦發育以及神經組織形成和修復的能 力，預防哮喘、癌癥、抑郁、肥胖、免疫紊亂以及心血管疾病等。但是人體自身不能合成這些 脂肪酸，需要從富含ω-3LC-PUFAS的食物(如深海魚油）中攝取。由于大肆捕撈和環境污染 破壞，深海魚類提供的《-3LC-PUFAs已無法滿足日益增長的市場需求，所以利用微生物生 產co-3LCPUFAs已經成為當前的研究熱點。
[0003] 由AA合成EPA的反應是通過ω -3脫飽和酶催化完成的。不同物種來源的ω -3脫飽 和酶對催化的底物具有明顯的偏好性，其中偏好催化20碳PUFAs的ω -3脫飽和酶可以較高 效的催化ΑΑ生成ΕΡΑ，對于ΕΡΑ的生產有十分重要的作用。2004年，Pereira等人發現來源于 異枝水霉的ω-3脂肪酸脫飽和酶sddl7,對18碳的多不飽和脂肪酸沒有催化活性，卻能將20 碳的AA催化為EPA，轉化率為25.9%。同樣的，來源于致病疫霉的ω-3脫飽和酶0ΡΙΝ 17也不 能以18碳的多不飽和脂肪酸為底物，但是對ΑΑ的轉化率達到了 30.94%。
[0004] 近年來，Xue等人從瓜果腐霉、大豆疫霉菌、櫟樹猝死病菌中分離出三種ω -3脫飽 和酶一PaD 17、PsD 17、PrD 17,這三種酶對18碳和20碳的ω-6多不飽和脂肪酸都具有催化 能力，但偏好催化20碳的ΑΑ，轉化率分別達到了 56 %、47 %和36 %。上述幾種ω -3脫飽和酶 可以直接、高效的催化ΑΑ生成ΕΡΑ，且催化反應均可在常溫下進行，因此對ΕΡΑ的工業化生產 具有十分重要的作用。其中PaD 17是目前已知的對ΑΑ轉化率最高的ω -3脫飽和酶。
[0005] 申請人在前期研究中將優化后的PaD 17轉化入高山被孢霉，得到的高山被孢霉重 組菌可以在28°C下生產EPA，且EPA含量達到總脂肪酸含量的18.7%，具有高于當時其他現 有技術的產率。
[0006] 然而，獲得具有更優秀的EPA產率的產油真菌特別是高山被孢霉依然是本領域技 術人員的期望。 【
【發明內容】
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[0007] 本發明的目的是克服現有技術的缺陷，提供一株能在常溫環境下高產EPA的重組 高山被孢霉工程菌株，借助根瘤土壤桿菌介導的方法、通過過表達其他來源的ω-3脫飽和 酶〇PpFADS17基因得到一株重組高山被孢霉，還涉及將所述重組高山被孢霉工程菌株用于 工業生產脂肪酸、特別是生產EPA。
[0008] 本申請人在中國發明專利申請CN 2015109025795中公開了三種常溫偏好20C的 ω-3脫飽和酶，其中涉及來源于寄生疫霉的ω-3脫飽和酶，并公開了依據釀酒酵母特性將 其優化得到〇PpFADS17序列，通過化學法轉入釀酒酵母INVSc 1中并成功表達，驗證了所得 工程菌株對ARA具有良好的轉化效率。
[0009]經過上述前期研究，申請人期望驗證在比高山被孢霉中過表達來源于寄生疫霉的 ω -3脫飽和酶能夠提高高山被孢霉的EPA產量，并期望從中獲得一株產量突出的工程菌株。
[0010]為了實現上述目的，本發明在現有研究的基礎上，對來自寄生疫霉的ω -3脫飽和 酶進行優化，得到經過優化的〇PpFADS17,其與天然的來源于瓜果腐霉的PaD 17具有相似的 催化特性，且對20C底物的偏好性更強。所以，將〇PpFADS17轉化入高山被孢霉尿嘧啶營養缺 陷型菌株，構建常溫下EPA產量更高的高山被孢霉。
[0011]具體地，本發明提供一株過表達來源于寄生疫霉的ω-3脫飽和酶〇PpFADS17基因 的重組高山被孢霉(1〇1*1:丨6代113 3]^;[仙)1^-0?口?六0317-4，該菌株于2016年1月18日保藏 于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區北辰西路1號院3 號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 11820。
[0012] 在本發明中，所述ω-3脫飽和酶〇PpFADS17基因是經過優化的來源于寄生疫霉的 ω-3脫飽和酶基因，其核酸序列如SEQ N0.1(Genbank accession N〇:KT372001)所示，其氨 基酸序列如SEQ NO.2所示。
[0013] 在本發明中，所述高山被孢霉菌株是用含有ω-3脫飽和酶〇PpFADS17基因的重組 質粒pBIG2_ura5s-〇PpFADS17轉化根瘤土壤桿菌后，再以含轉化質粒pBIG2_ura5s_ oPpFADS 17的根瘤土壤桿菌轉化高山被孢霉尿嘧啶營養缺陷型菌株構建而成的。
[0014] 根據一種優選的實施方式，所述高山被孢霉尿嘧啶營養缺陷型菌株是一株使高山 被孢霉ATCC32222基因組中編碼乳清酸磷酸核糖轉移酶OPRTase的ura5基因失活的高山被 孢霉菌株。更優選地，所述高山被孢霉尿嘧啶營養缺陷型菌株是中國發明專利申請CN 201310347934.8中公開的高山被孢霉MAU1，該菌株于2013年11月01日保藏于中國微生物菌 種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.8414。該菌株也保存于江南大學 的實驗室，被命名為CCFM501。
[0015] 為了獲得上述重組高山被孢霉，本發明還提供所述菌株的構建方法，包括以下步 驟：
[0016] a)根據天然的來源于寄生疫霉的ω-3脫飽和酶序列(Genbank accession No :XM_ 008906963)，根據高山被孢霉密碼子使用偏好性，人工合成優化后的ω-3脫飽和酶基因 oPpFADS17,如SEQ NO. l(Genbank accession Ν〇:ΚΤ372001)所示；
[0017] b)構建重組質粒 pBIG2-ura5s-〇PpFADS17;
[0018] c)用構建獲得的重組質粒pBIG2-ura5s-〇PpFADS17轉化根瘤土壤桿菌；
[0019] d)用含重組質粒pBIG2-ura5s-〇PpFADS17的根瘤土壤桿菌轉化高山被孢霉尿嘧啶 營養缺陷型菌株；
[0020] e)篩選鑒定轉化菌株，獲得一株特別高產EPA的過表達ω-3脫飽和酶〇PpFADS17基 因的重組高山被孢霉菌株MA-〇PpFADSl 7-4。
[0021 ] 其中，步驟c)的根瘤土壤桿菌為根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens) C58Cl〇
[0022] 步驟d)的高山被孢霉尿嘧啶營養缺陷型菌株是重組高山被孢霉MAU1 (CGMCC No. 8414)，或按照江南大學的實驗室的命名稱為CCFM501。
[0023] 其中，步驟e)中篩選鑒定轉化菌株的方法包括以下步驟：
[0024] 1)用3mL生理鹽水沖刷GY表面，收集液體于一個無菌1.5mL離心管中。
[0025]過 25μπι 濾膜；
[0026] 2)用血球計數器計數，調整為三種孢子濃度梯度108個每100yL、10 6個每100yL、104 個每100yL，各取200yL涂布于含有100yg/mL壯觀霉素，100yg/mL頭孢噻肟的GY-CS平板上， 25°C避光培養2-3d;
[0027] 3)隨時用無菌鑷子挑出生長的真菌菌絲于含有lOOyg/mL壯觀霉素，lOOyg/mL頭孢 噻肟的SC-CS平板上，25°C培養2-3d;
[0028] 4)觀察高山被孢霉在平板上的生長情況，挑出在SC-CS平板上生長的菌絲接種于 GY斜面上；
[0029] 5)將上述步驟4)中平板上的高山被孢霉菌株孢子在GY斜面上傳代三次；
[0030] 6)將穩定遺傳的菌株鑒定為過表達ω -3脫飽和酶oPpFADS 17基因的重組高山被孢 霉菌株，保藏于GY斜面上；
[0031] 7)提取含有ω-3脫飽和酶oPpFADS17基因的重組高山被孢霉菌株的基因組DNA，設 計一對與啟動子和終止子特異性結合的引物進行PCR驗證：
[0032] PI (sense)：CACACACAAACCTCTCTCCCACT
[0033] P2(antisense)：CAAATGAACGTATCTTATCGAGATCC；
[0034] 8)所述重組菌株保藏于GY斜面上。
[0035] 本發明還提供上述重組高山被孢霉菌株或根據上述方法得到的重組高山被孢霉 在生產脂肪酸、特別是EPA中的用途。
[0036] 在本發明中，重組質粒pBIG2-ura5s-〇PpFADS17的構建可參考中國專利申請 CN201310524221.4中公開的內容。根據該申請的記載，首先用PCR的方法從pD4質粒上獲得 HPH表達單元，將HPH表達單元用限制性內切酶EcoR I和Xba I酶切，插入到EcoR I和Xba I 酶切過的pET28a( + )的多克隆位點(MCS)中，得到質粒pET28a-HPHs。利用PCR從高山被孢霉 cDNA中獲得ura5(乳清酸磷酸核糖轉移酶;OPRTase)基因，并利用限制性內切酶BspH I和 BamH I酶切ura5基因，將酶切過的ura5基因插入到Nco I和BamH I酶切過的質粒pET28a_ HPHs中，以替換hpt基因，構建質粒pET28a-ura5s。用限制性內切酶EcoR I和Xba I酶切質粒 pET28a_ura5s得到ura5s表達單元。將ura5s表達單元替換質粒