一株解淀粉芽孢桿菌的篩選及其在刺參養殖上的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及功能微生物篩選及應用技術領域，具體涉及一株解淀粉芽孢桿菌的篩 選及其在刺參養殖上的應用。
【背景技術】
[0002] 隨著國內外刺參需求量的增加及水產品貿易的國際化發展，近年來，刺參養殖業 發展突飛猛進。但是，高密度養殖及不規范操作所導致的養殖環境惡化、疾病的發生給刺參 養殖業帶來了巨大的經濟損失。傳統防治疾病的方法主要是使用抗生素，抗生素使用易產 生耐藥性菌株問題，且存在動物體內殘留問題，危害食品安全，因此尋找抗生素替代品成為 必然。
[0003] 益生菌作為外源的添加劑可以參與動物體內的微生物平衡，直接通過增強動物對 腸內有害微生物群落的抑制作用，或通過增強非特異性免疫功能來預防疾病，進而間接起 到促進動物生長的作用，提高動物飼料的轉化率。因此，近些年對于益生菌的篩選尤其是養 殖動物土著菌的篩選成為本領域內的研究熱點，也對水產飼料配方的改進具有重要的意 義。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一株新型解淀粉芽孢桿菌及其在刺參養殖上的應用。所述解 淀粉芽孢桿菌篩選自健康刺參腸道，該菌株具有較強的產蛋白酶和淀粉酶能力，能夠提高 刺參腸道中淀粉酶活力，促進刺參的生長，提高刺參的免疫力和抗病力，可廣泛應用于刺參 的養殖及水產飼料領域。
[0005] 本發明一方面提供了一株解淀粉芽孢桿菌，于2015年12月24日保藏于中國典型培 養物保藏中心，其簡稱為CCTCC，地址為:湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學保藏中心;請求 保藏人:魯東大學;保藏編號為CCTCC N0:M2015774,該菌命名為解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens ZYTC1-1〇
[0006] 本發明另一方面提供了上述解淀粉芽孢桿菌在刺參養殖中的應用。具體為：當刺 參苗變態為稚參后，攝食能力進一步加強，每斤刺參在2000-4000頭時，在鼠尾藻粉中以 10 9CFU/g的添加量投喂上述解淀粉芽孢桿菌，連續投喂一個月。
[0007] 本發明篩選到的解淀粉芽孢桿菌ZYTC1-1，具有較強的產蛋白酶和淀粉酶的能力， 促進刺參生長，降低刺參病害發生的幾率。所述解淀粉芽孢桿菌ZYTC1-1可作為益生菌應用 于刺參的養殖生產過程中，有效提高刺參腸道中淀粉酶活力，對刺參的生長具有顯著的促 進作用，還可以有效提高刺參的免疫力及對燦爛弧菌的抵抗能力。與對照組相比，添加1〇 9 CFU/g解淀粉芽孢桿菌ZYTC1-1的益生菌組中刺參的終末平均體重、特定生長率、淀粉酶活 性、吞噬活性、超氧化物歧化酶活性、總抗氧化力活性和一氧化氮合酶活性分別提高了 17 · 72%、17 · 77%、81 · 34%、41 · 99%、8 · 47%、61 · 70% 及 54 · 21%，而累積死亡率下降了 25%;取得了 顯著的技術效果。
【附圖說明】
[0008] 圖1:本發明一株解淀粉芽孢桿菌ZYTC1-1的菌落形態。
[0009] 解淀粉芽孢桿菌ZYTC1 -1，已于2015年12月24日保藏于中國典型培養物保藏中心， 其簡稱為CCTCC，其保藏編號為CCTCC Ν0:Μ 2015774。
【具體實施方式】
[0010]下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明作更進一步的說明，以便本領域的技術人 員了解本發明。
[0011] 實施例1 菌株的分離、篩選、鑒定及安全性驗證 1、樣品 采集于煙臺市萊州刺參養殖場的健康刺參的腸道。
[0012] 2、培養基： 1)芽孢桿菌分離培養基:葡萄糖l〇g，磷酸鈣5g，硫酸銨0.5g，氯化鉀0.2g，七水硫酸鎂 〇. lg，硫酸錳〇.〇〇〇lg，硫酸亞鐵〇.〇〇〇lg，酵母提取物〇. 5g，蒸餾水1000ml，pH6.8-7.2，瓊脂 20g，121 °C滅菌 30min。
[0013] 2)改良的TSB培養基：胰蛋白胨大豆肉湯培養基（TSB)30g，氯化鈉10g，蒸餾水 1000ml，pH7 · 4-7 · 6，配制固體培養基加入15-20g的瓊脂，12Γ C滅菌20min。
[0014] 3)淀粉水解培養基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，可溶性淀粉2g，蒸餾水 1000ml，ρΗ7·2-7·4,配制固體培養基加入15-20g的瓊脂，115 °C滅菌20min。
[0015] 4)酪素水解雙層平板培養基：（1)溶液A:蛋白胨10g、酵母膏3g、瓊脂10g、陳海水 1000ml; (2)溶液B:酪蛋白10g、蒸餾水250ml; (3)溶液C:瓊脂10g、蒸餾水250ml。在堿性 條件下溶解酪蛋白，配制溶液B時，滴加 NaOH溶液使酪蛋白剛好全部溶解。分別將三種溶液 滅菌（121°C，20min)，待其都冷卻到50 °C左右，先將B液和C液混合，倒入平板形成一薄層， 待薄層凝固后將A液倒入，制成雙層平板。
[0016] 3、篩選方法 健康刺參從養殖場采集后，加冰運輸至實驗室，無菌條件下解剖獲得刺參腸道，腸道稱 重后，加入9倍體積的無菌生理鹽水，用勻漿器在冰上進行研磨，充分研磨后進行10倍梯度 稀釋，接種芽孢桿菌分離培養基，28 ° C培養24h-48h。選取均勻清晰的單菌落，在改良的TSB 培養基上劃線純化。純化后的細菌，用改良的TSB液體培養基擴大培養，用甘油生理鹽水-80 °C 保存。單菌落依次命名為 ZYTC1-1、ZYTC1-2、ZYTC1_3、……、ZYTC1_9。
[0017] 將單菌落過夜培養16-18h，分別點種于淀粉水解培養基和酪素水解雙層平板培養 基上，每種菌點種3個重復，28°C恒溫培養，48 h形成明顯菌落后觀察透明圈的大小;淀粉水 解培養基需滴加盧戈氏碘液。具體結果如表1所示。
[0018] 表1潛在益生菌株產酶能力
注：1表示不產生蛋白酶或者淀粉酶，1-2表示產酶能力一般，>2表示產酶能力較強。
[0019] 從表1的數據可以看出，本發明篩選到的9株芽孢桿菌中菌株ZYTC1 -1產蛋白酶和 淀粉酶的能力最強。
[0020] 4、菌株鑒定 1)菌落形態特征:將上述菌株ZYTC1-1重新劃線培養，其單菌落呈現為扁平狀、圓形、土 黃色、邊緣鋸齒狀，革蘭氏染色陽性。
[0021] 2)提取上述菌株ZYTC1-1的基因組DNA，利用PCR技術擴增16S rDNA序列，通過測序 獲得ZYTC1-1的16S rDNA序列，具體序列見附件序列表的核苷酸序列，將該菌株的16S rDNA 序列提交到GenBank數據庫，獲得序列號GenBank NO· KU588858。通過BLAST比對分析，其與 已公布的多株解淀粉芽孢桿菌的16S rDNA序列相似度高達99%，鑒定證實菌株ZYTC1-1為解 淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)，與生化鑒定結果一致。
[0022] 3)將上述菌株ZYTC1-1命名為解淀粉芽孢桿菌ZYTCl-l(Bacillus amyloliquefaciens ZYTC1-1)，已于2015年12月24日保藏于中國武漢武漢大學的中國典 型培養物保藏中心，其保藏編號為CCTCC NO:M 2015774。
[0023] 5、安全性驗證 益生菌的篩選應以安全性為出發點，因此安全性檢驗是益生菌篩選中必不可少的環 節，小規模的浸浴實驗是判斷潛在益生菌對養殖動物幼體安全性的常用方法。使用平均體 重為〇. 2g的刺參，